Dankie dat jy Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat jy gebruik het beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). In die tussentyd, om volgehoue ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Termofiele is mikroörganismes wat by hoë temperature floreer. Deur hulle te bestudeer kan waardevolle inligting verskaf oor hoe die lewe by uiterste toestande aanpas. Dit is egter moeilik om hoë temperatuur toestande met konvensionele optiese mikroskope te bereik. Verskeie tuisgemaakte oplossings gebaseer op plaaslike weerstandige elektriese verhitting is voorgestel, maar daar is geen eenvoudige kommersiële oplossing nie. In hierdie vraestel stel ons die konsep van mikroskaal laserverhitting oor die mikroskoopveld bekend om hoë temperature vir termofielstudies te verskaf terwyl die gebruiker se omgewing sag gehou word. Mikroskaalverhitting teen matige laserintensiteit kan bereik word deur 'n goue nanopartikel-bedekte substraat as 'n bioversoenbare en doeltreffende ligabsorbeerder te gebruik. Moontlike effekte van mikroskaal vloeistofkonveksie, selretensie en sentrifugale termoforetiese beweging word bespreek. Die metode is in twee spesies gedemonstreer: (i) Geobacillus stearothermophilus, 'n aktiewe termofiele bakterie wat teen ongeveer 65°C voortplant, wat ons waargeneem het dat dit ontkiem, groei en swem onder mikroskaalverhitting; (ii) Thiobacillus sp., 'n optimaal hipertermofiele archaea. by 80°C. Hierdie werk baan die weg vir eenvoudige en veilige waarneming van termofiele mikroörganismes met behulp van moderne en bekostigbare mikroskopie-instrumente.
Oor miljarde jare het lewe op Aarde ontwikkel om aan te pas by 'n wye reeks omgewingstoestande wat soms vanuit ons menslike perspektief as ekstreem beskou word. In die besonder floreer sommige termofiele mikroörganismes (bakterieë, archaea, swamme) wat termofiele genoem word in die temperatuurreeks van 45°C tot 122°C1, 2, 3, 4. Termofiele leef in verskeie ekosisteme, soos diepsee hidrotermiese openinge, warmwaterbronne of vulkaniese gebiede. Hul navorsing het die afgelope paar dekades baie belangstelling gegenereer om ten minste twee redes. Eerstens kan ons by hulle leer, byvoorbeeld hoe termofiele 5, 6, ensieme 7, 8 en membrane 9 stabiel is by sulke hoë temperature, of hoe termofiele uiterste vlakke van bestraling kan weerstaan10. Tweedens is dit die basis vir baie belangrike biotegnologiese toepassings1,11,12 soos brandstofproduksie13,14,15,16, chemiese sintese (dihidro, alkohole, metaan, aminosure, ens.)17, biomynbou18 en termostabiele biokatalisators7 ,11, 13. Die tans bekende polimerasekettingreaksie (PCR)19 behels veral 'n ensiem (Taq-polimerase) wat uit die termofiele bakterie Thermus aquaticus geïsoleer is, een van die eerste termofiele wat ontdek is.
Die studie van termofiele is egter nie 'n maklike taak nie en kan nie in enige biologiese laboratorium geïmproviseer word nie. In die besonder kan lewende termofiele nie in vitro met enige standaard ligmikroskoop waargeneem word nie, selfs met kommersieel beskikbare verhittingskamers, gewoonlik gegradeer vir temperature so laag as 40°C. Sedert die 1990's het slegs 'n paar navorsingsgroepe hulle toegewy aan die bekendstelling van hoë-temperatuur mikroskopie (HTM) stelsels. In 1994 het Glukh et al. Die verhitting/verkoelingskamer is ontwerp op grond van die gebruik van 'n Peltier-sel wat die temperatuur van reghoekige kapillêre gesluit beheer om anaërobiteit 20 te handhaaf. Die toestel kan tot 100 °C verhit word teen 'n tempo van 2 °C/s, wat die skrywers in staat stel om die beweeglikheid van die hipertermofiele bakterie Thermotoga maritima21 te bestudeer. In 1999 het Horn et al. 'n Baie soortgelyke toestel is ontwikkel, steeds gebaseer op die gebruik van verhitte kapillêre wat geskik is vir kommersiële mikroskopie om seldeling/verbinding te bestudeer. Na 'n lang tydperk van relatiewe onaktiwiteit is die soektog na effektiewe HTM's in 2012 hervat, veral in verband met 'n reeks referate deur die Wirth-groep wat 'n toestel gebruik wat deur Horn et al. Vyftien jaar gelede is die beweeglikheid van 'n groot aantal archaea, insluitend hipertermofiele, by temperature tot 100°C bestudeer met behulp van verhitte kapillêre23,24. Hulle het ook die oorspronklike mikroskoop aangepas om vinniger verhitting te verkry ('n paar minute in plaas van 35 minute om die vasgestelde temperatuur te bereik) en 'n lineêre temperatuurgradiënt van meer as 2 cm oor die medium te bereik. Hierdie temperatuurgradiëntvormingstoestel (TGFD) is gebruik om die mobiliteit van baie termofiele binne temperatuurgradiënte op biologies relevante afstande 24, 25 te bestudeer.
Verhitting van geslote kapillêre is nie die enigste manier om lewende termofiele waar te neem nie. In 2012 het Kuwabara et al. Tuisgemaakte weggooibare Pyrex-kamers verseël met hittebestande gom (Super X2; Cemedine, Japan) is gebruik. Die monsters is op 'n kommersieel beskikbare deursigtige verwarmingsplaat (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) geplaas wat tot 110°C kan verhit, maar nie oorspronklik bedoel vir biobeelding nie. Die skrywers het doeltreffende verdeling van anaërobiese termofiele bakterieë (Thermosipho globiformans, verdubbelingstyd 24 min) by 65°C waargeneem. In 2020 het Pulshen et al. Doeltreffende verhitting van kommersiële metaalskottels (AttofluorTM, Thermofisher) is gedemonstreer deur twee tuisgemaakte verwarmingselemente te gebruik: 'n deksel en 'n verhoog (PCR-masjien-geïnspireerde konfigurasie). Hierdie assosiasie lei tot 'n eenvormige vloeistoftemperatuur en voorkom verdamping en kondensasie aan die onderkant van die deksel. Die gebruik van 'n O-ring vermy gaswisseling met die omgewing. Hierdie HTM, wat die Sulfoskoop genoem word, is gebruik om Sulfolobus acidocaldarius by 75°C27 af te beeld.
'n Erkende beperking van al hierdie stelsels was die beperking tot die gebruik van lugdoelwitte, enige oliedompeling was ongeskik vir sulke hoë temperature en vir beeldvorming deur >1 mm dik deursigtige monsters. 'n Erkende beperking van al hierdie stelsels was die beperking tot die gebruik van lugdoelwitte, enige oliedompeling was ongeskik vir sulke hoë temperature en vir beeldvorming deur >1 mm dik deursigtige monsters. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объектив, сколектив е погружение в масло не подходило vir такой высокой температуры en vir визуализации через прозрачные 1 масло прозрачные >. 'n Erkende tekortkoming van al hierdie stelsels was die beperking op die gebruik van lugdoelwitte, aangesien enige oliedompeling nie geskik was vir sulke hoë temperature en vir visualisering deur deursigtige monsters > 1 mm dik nie.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都限制是限制使用空气物镜，任何油浸都业适合踄口毫米厚的透明样品成像. 'n Erkende beperking van al hierdie stelsels is die beperking van die gebruik van 'n lug-ingevoerde spieël, aangesien enige oliedompeling ongeskik is vir die beeld van deursigtige monsters >1 mm dik by sulke hoë temperature. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных обюмектин ружение в масло непригодно vir таких высоких температур en визуализации через прозрачные образцы мобразцы мойн. 'n Erkende nadeel van al hierdie stelsels is die beperkte gebruik van luglense, enige oliedompeling is ongeskik vir sulke hoë temperature en visualisering deur deursigtige monsters >1 mm dik.Meer onlangs is hierdie beperking opgehef deur Charles-Orzag et al. 28, wat 'n toestel ontwikkel het wat nie meer hitte rondom die stelsel van belang verskaf nie, maar eerder binne die dekglas self, bedek met 'n dun deursigtige laag van 'n weerstand gemaak van ITO (indium-tin oxide). Die deksel kan tot 75 °C verhit word deur 'n elektriese stroom deur die deursigtige laag te stuur. Die skrywer moet egter ook die lens tot die objektief verhit, maar nie meer as 65 °C nie, om dit nie te beskadig nie.
Hierdie werke toon dat die ontwikkeling van doeltreffende hoë-temperatuur optiese mikroskopie nie algemeen aanvaar is nie, dikwels tuisgemaakte toerusting vereis, en dikwels bereik word ten koste van ruimtelike resolusie, wat 'n ernstige nadeel is aangesien termofiele mikroörganismes nie groter as 'n paar is nie. mikrometers. Verminderde verwarmingsvolume is die sleutel tot die oplossing van drie inherente probleme van HTM: swak ruimtelike resolusie, hoë termiese traagheid wanneer die stelsel opwarm, en skadelike verhitting van omliggende elemente (dompelolie, objektieflens ... of gebruiker se hande) by uiterste temperature. ).
In hierdie vraestel stel ons 'n HTM bekend vir termofiele waarneming wat nie op weerstandsverhitting gebaseer is nie. In plaas daarvan het ons gelokaliseerde verhitting binne 'n beperkte gebied van die mikroskoop se gesigsveld bereik deur laserbestraling van 'n ligabsorberende substraat. Die temperatuurverspreiding is gevisualiseer met behulp van kwantitatiewe fasemikroskopie (QPM). Die doeltreffendheid van hierdie metode word gedemonstreer deur Geobacillus stearothermophilus, 'n beweeglike termofiele bakterie wat teen ongeveer 65°C reproduseer en 'n kort verdubbelingstyd het (ongeveer 20 minute), en Sulfolobus shibatae, 'n hipertermofiel wat optimaal groei by 80°C (archaea) te illustreer. Normale replikasietempo en swem is waargeneem as 'n funksie van temperatuur. Hierdie laser HTM (LA-HTM) word nie beperk deur die dikte van die dekstrook of deur die aard van die objektief (lug- of oliedompeling) nie. Dit laat enige hoë resolusie lens op die mark toe om gebruik te word. Dit ly ook nie aan stadige verhitting as gevolg van termiese traagheid nie (bereik kitsverhitting op 'n millisekonde skaal) en gebruik slegs kommersieel beskikbare komponente. Die enigste nuwe veiligheidskwessies hou verband met die teenwoordigheid van kragtige laserstrale (gewoonlik tot 100 mW) binne die toestel en moontlik deur die oë, wat beskermende bril benodig.
Die beginsel van LA-HTM is om 'n laser te gebruik om die monster plaaslik binne die gesigsveld van die mikroskoop te verhit (Fig. 1a). Om dit te doen, moet die monster lig-absorberend wees. Om 'n redelike laserkrag (minder as 100 mW) te gebruik, het ons nie staatgemaak op die absorpsie van lig deur die vloeibare medium nie, maar die absorpsie van die monster kunsmatig verhoog deur die substraat met goue nanopartikels te bedek (Fig. 1c). Verhitting van goue nanopartikels met lig is van fundamentele belang vir die veld van termiese plasmonika, met verwagte toepassings in biomedisyne, nanochemie of sonlig-oes29,30,31. Oor die afgelope paar jaar het ons hierdie LA-HTM gebruik in verskeie studies wat verband hou met termiese plasma-toepassings in fisika, chemie en biologie. Die grootste probleem met hierdie metode is om die finale temperatuurprofiel te vertoon, aangesien die verhoogde temperatuur beperk is tot 'n mikroskaalgebied binne die monster. Ons het getoon dat temperatuurkartering bereik kan word met die vier-golflengte transversale skuif-interferometer, 'n eenvoudige, hoë-resolusie en baie sensitiewe metode van kwantitatiewe fasemikroskopie gebaseer op die gebruik van tweedimensionele diffraksieroosters (ook bekend as kruisroosters). 33,34,35,36. Die betroubaarheid van hierdie termiese mikroskopie-tegniek, gebaseer op kruisrooster-golffrontmikroskopie (CGM), is gedemonstreer in 'n dosyn artikels wat oor die afgelope dekade gepubliseer is37,38,39,40,41,42,43.
Skema van installering van parallelle laser verwarming, vorming en temperatuur mikroskoop. b Monstergeometrie wat bestaan uit 'n AttofluorTM-kamer wat 'n dekstrook bevat wat met goue nanopartikels bedek is. c Kyk mooi na die steekproef (nie volgens skaal nie). d verteenwoordig die eenvormige laserstraalprofiel en (e) die gesimuleerde daaropvolgende temperatuurverspreiding op die monstervlak van die goue nanopartikels. f is 'n ringvormige laserstraalprofiel wat geskik is vir die opwekking van 'n eenvormige temperatuur soos getoon in die simulasie van die gevolglike temperatuurverspreiding wat in (g) getoon word. Skaalbalk: 30 µm.
Ons het veral onlangs verhitting van soogdierselle met LA-HTM en CGM behaal en sellulêre hitteskokreaksies in die reeks van 37-42°C opgespoor, wat die toepaslikheid van hierdie tegniek op enkellewende selbeelding demonstreer. Die toepassing van LA-HTM op die studie van mikroörganismes by hoë temperature is egter nie ondubbelsinnig nie, aangesien dit meer versigtigheid verg in vergelyking met soogdierselle: eerstens lei die verhitting van die bodem van die medium met tientalle grade (eerder as 'n paar grade) tot 'n sterk vertikale temperatuurgradiënt. kan vloeistofkonveksie 44 skep wat, indien dit nie stewig aan die substraat geheg is nie, ongewenste beweging en vermenging van bakterieë kan veroorsaak. Hierdie konveksie kan uitgeskakel word deur die dikte van die vloeistoflaag te verminder. Vir hierdie doel, in al die eksperimente wat hieronder aangebied word, is bakteriese suspensies tussen twee dekstrokies van ongeveer 15 µm dik geplaas wat binne 'n metaalbeker geplaas is (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). In beginsel kan konveksie vermy word as die dikte van die vloeistof kleiner is as die straalgrootte van die verwarmingslaser. Tweedens kan werk in so 'n beperkte meetkunde aërobiese organismes versmoor (sien Fig. S2). Hierdie probleem kan vermy word deur 'n substraat te gebruik wat deurlaatbaar is vir suurstof (of enige ander noodsaaklike gas), deur vasgevange lugborrels binne die dekstrook te laat, of deur gate in die boonste dekstrook te boor (sien Fig. S1) 45 . In hierdie studie het ons laasgenoemde oplossing gekies (Figure 1b en S1). Laastens bied laserverhitting nie eenvormige temperatuurverspreiding nie. Selfs by dieselfde intensiteit van die laserstraal (Fig. 1d), is die temperatuurverspreiding nie eenvormig nie, maar lyk dit eerder soos die Gaussiese verspreiding as gevolg van termiese diffusie (Fig. 1e). Wanneer die doel is om presiese temperature in die gesigsveld vas te stel vir die bestudering van biologiese sisteme, is ongelyke profiele nie ideaal nie en kan dit ook lei tot termoforetiese beweging van bakterieë as hulle nie aan die substraat kleef nie (sien Fig. S3, S4)39. Vir hierdie doel het ons 'n ruimtelike ligmodulator (SLM) gebruik om die infrarooi laserstraal volgens die vorm van die ring (Fig. 1f) in die vlak van die monster te vorm om 'n perfek eenvormige temperatuurverspreiding binne 'n gegewe geometriese area te verkry, ten spyte van termiese diffusie (Fig. 1d) 39, 42, 46. Plaas 'n boonste dekglans oor 'n metaalskottel (Figuur 1b) om verdamping van die medium te vermy en hou dit vir ten minste 'n paar dae waar. Omdat hierdie boonste dekstrook nie verseël is nie, kan bykomende medium maklik enige tyd bygevoeg word indien nodig.
Om te illustreer hoe LA-HTM werk en die toepaslikheid daarvan in termofiele navorsing te demonstreer, het ons die aërobiese bakterieë Geobacillus stearothermophilus bestudeer, wat 'n optimum groeitemperatuur van ongeveer 60-65°C het. Die bakterie het ook flagella en die vermoë om te swem, wat nog 'n aanduiding van normale sellulêre aktiwiteit verskaf.
Monsters (Fig. 1b) is vooraf by 60°C vir een uur geïnkubeer en dan in 'n LA-HTM monsterhouer geplaas. Hierdie voor-inkubasie is opsioneel, maar steeds nuttig, om twee redes: Eerstens, wanneer die laser aangeskakel word, veroorsaak dit dat die selle onmiddellik groei en verdeel (sien fliek M1 in Supplementary Materials). Sonder pre-inkubasie word bakteriese groei tipies met ongeveer 40 minute vertraag elke keer as 'n nuwe kykarea op die monster verhit word. Tweedens het die 1 uur voor-inkubasie adhesie van die bakterieë aan die dekstrook bevorder, wat verhoed dat selle uit die gesigsveld dryf as gevolg van termoforese wanneer die laser aangeskakel is (sien film M2 in Aanvullende Materiale). Termoforese is die beweging van deeltjies of molekules langs 'n temperatuurgradiënt, gewoonlik van warm na koud, en bakterieë is geen uitsondering nie43,47. Hierdie ongewenste effek word oor 'n gegewe area uitgeskakel deur SLM te gebruik om die laserstraal te vorm en 'n plat temperatuurverspreiding te verkry.
Op fig. Figuur 2 toon die temperatuurverspreiding gemeet deur CGM verkry deur 'n glassubstraat bedek met goue nanopartikels met 'n ringvormige laserstraal te bestraal (Fig. 1f). 'n Plat temperatuurverspreiding is waargeneem oor die hele area wat deur die laserstraal gedek is. Hierdie sone is op 65°C gestel, die optimale groeitemperatuur. Buite hierdie gebied val die temperatuurkromme natuurlik na \(1/r\) (waar \(r\) die radiale koördinaat is).
'n Temperatuurkaart van CGM-metings verkry deur 'n ringvormige laserstraal te gebruik om 'n laag goue nanopartikels te bestraal om 'n plat temperatuurprofiel oor 'n sirkelvormige area te verkry. b Isoterm van die temperatuurkaart (a). Die kontoer van die laserstraal word deur 'n grys gestippelde sirkel voorgestel. Die eksperiment is twee keer herhaal (sien aanvullende materiale, figuur S4).
Die lewensvatbaarheid van bakteriële selle is vir etlike ure gemonitor met LA-HTM. Op fig. 3 toon die tydinterval vir vier beelde geneem uit 'n 3 uur 20 minute fliek (Movie M3, Aanvullende Inligting). Daar is waargeneem dat bakterieë aktief prolifereer binne die sirkelvormige area wat deur die laser gedefinieer is waar die temperatuur optimaal was, wat 65°C nader. Daarteenoor is selgroei aansienlik verminder toe die temperatuur vir 10 s onder 50°C gedaal het.
Optiese dieptebeelde van G. stearothermophilus-bakterieë wat groei na laserverhitting op verskillende tye, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, uit 200 Onttrek uit 'n film van een minuut (M3-film verskaf in aanvullende inligting) wat op die ooreenstemmende temperatuurkaart gesuperponeer is. Die laser skakel op op tyd \(t=0\). Isoterme is by die intensiteitsbeeld gevoeg.
Om selgroei en sy afhanklikheid van temperatuur verder te kwantifiseer, het ons die toename in biomassa van verskeie kolonies van aanvanklik geïsoleerde bakterieë in die Movie M3-gesigveld gemeet (Fig. 4). Die ouerbakterieë wat gekies is aan die begin van die vorming van minikolonievormende eenheid (mCFU) word in Figuur S6 getoon. Droëmassametings is geneem met 'n CGM 48-kamera wat gebruik is om die temperatuurverspreiding te karteer. Die vermoë van die CGM om droë gewig en temperatuur te meet is die sterkte van die LA-HTM. Soos verwag, het hoë temperatuur vinniger bakteriese groei veroorsaak (Fig. 4a). Soos getoon in die semi-log plot in Fig. 4b, volg groei by alle temperature eksponensiële groei, waar die data die eksponensiële funksie gebruik \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), waar \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}}2\) – generasietyd (of verdubbelingstyd), \( g =1/ \tau\) – groeikoers (aantal afdelings per tydseenheid ). Op fig. 4c toon die onderskeie groeitempo en generasietyd as 'n funksie van temperatuur. Vinnig groeiende mCFU's word gekenmerk deur versadiging van groei na twee uur, 'n verwagte gedrag as gevolg van hoë bakteriese digtheid (soortgelyk aan die stilstaande fase in klassieke vloeibare kulture). Die algemene vorm \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) stem ooreen met die verwagte twee-fase kurwe vir G. stearothermophilus met 'n optimale groeitempo rondom 60-65°C. Pas die data by die gebruik van 'n kardinale model (Figuur S5)49 waar \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, wat goed ooreenstem met ander waardes wat in die literatuur aangehaal word49. Alhoewel die temperatuurafhanklike parameters reproduseerbaar is, kan die maksimum groeitempo van \({G}_{0}\) van een eksperiment na 'n ander verskil (sien figure S7-S9 en film M4). In teenstelling met temperatuurpasparameters, wat universeel behoort te wees, hang die maksimum groeitempo af van die eienskappe van die medium (beskikbaarheid van voedingstowwe, suurstofkonsentrasie) binne die waargenome mikroskaalgeometrie.
a Mikrobiese groei by verskillende temperature. mCFU: Miniatuurkolonievormende eenhede. Data verkry uit 'n video van 'n enkele bakterie wat in 'n temperatuurgradiënt groei (film M3). b Dieselfde as (a), semi-logaritmiese skaal. c Groeitempo\(\tau\) en generasietyd\(g\) bereken vanaf lineêre regressie (b). Horisontale foutstawe: temperatuurreeks waaroor mCFU's uitgebrei het na die gesigsveld tydens groei. Vertikale foutstawe: lineêre regressie standaardfout.
Benewens normale groei, het sommige bakterieë soms tydens laserverhitting in sig gedryf, wat 'n verwagte gedrag is vir bakterieë met flagella. Die fliek M5 in addisionele inligting wys sulke swemaktiwiteite. In hierdie eksperiment is eenvormige laserstraling gebruik om 'n temperatuurgradiënt te skep, soos getoon in Figure 1d, e en S3. Figuur 5 toon twee beeldreekse wat uit die M5-fliek gekies is wat wys dat een bakterie rigtinggewende beweging vertoon terwyl alle ander bakterieë roerloos bly.
Die twee tydraamwerke (a) en (b) toon die swem van twee verskillende bakterieë wat met stippelsirkels gemerk is. Die beelde is uit die M5-fliek onttrek (verskaf as aanvullende materiaal).
In die geval van G. stearothermophilus het die aktiewe beweging van bakterieë (Fig. 5) 'n paar sekondes nadat die laserstraal aangeskakel is, begin. Hierdie waarneming beklemtoon die tydelike reaksie van hierdie termofiele mikro-organisme op 'n toename in temperatuur, soos reeds waargeneem deur Mora et al. 24 . Die onderwerp van bakteriële beweeglikheid en selfs termotaksis kan verder ondersoek word met behulp van LA-HTM.
Mikrobiese swem moet nie met ander tipes fisiese beweging verwar word nie, naamlik (i) Brownse beweging, wat blyk te wees chaotiese beweging met geen definitiewe rigting nie, (ii) konveksie 50 en termoforese 43, wat bestaan uit 'n gereelde beweging van beweging langs 'n temperatuur gradiënt.
G. stearothermophilus is bekend vir sy vermoë om hoogs weerstandbiedende spore (spoorvorming) te produseer wanneer dit as verdediging aan ongunstige omgewingstoestande blootgestel word. Wanneer omgewingstoestande weer gunstig word, ontkiem die spore, vorm lewende selle en hervat groei. Alhoewel hierdie sporulering/ontkiemingsproses welbekend is, is dit nog nooit in reële tyd waargeneem nie. Deur LA-HTM te gebruik, rapporteer ons hier die eerste waarneming van ontkiemingsgebeure in G. stearothermophilus.
Op fig. 6a toon tydsverloopbeelde van optiese diepte (OT) verkry met behulp van 'n CGM-stel van 13 spore. Vir die hele versamelingstyd (15 h 6 min, \(t=0\) – die begin van laserverhitting), het 4 uit 13 spore ontkiem, op opeenvolgende tydpunte \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' en \(11\) h \(30\)'. Alhoewel slegs een van hierdie gebeurtenisse in Figuur 6 getoon word, kan 4 ontkiemingsgebeure in die M6-film in die aanvullende materiaal waargeneem word. Interessant genoeg blyk ontkieming lukraak te wees: nie alle spore ontkiem nie en ontkiem nie op dieselfde tyd nie, ten spyte van dieselfde veranderinge in omgewingstoestande.
'n Tydsverloop wat bestaan uit 8 OT-beelde (oliedompeling, 60x, 1.25 NA-doelwit) en (b) biomassa-evolusie van G. stearothermophilus-aggregate. c (b) Geteken op 'n semi-log skaal om die lineariteit van die groeitempo (gestreepte lyn) uit te lig.
Op fig. 6b,c toon die biomassa van selpopulasies in die gesigsveld as 'n funksie van tyd oor die hele tydperk van data-insameling. Die vinnige verval van die droë massa waargeneem by \(t=5\)h in fig. 6b, c, as gevolg van die uitgang van sommige selle uit die gesigsveld. Die groeitempo van hierdie vier gebeurtenisse is \(0.77\pm 0.1\) h-1. Hierdie waarde is hoër as die groeitempo wat verband hou met Figuur 3. 3 en 4, waar selle normaal groei. Die rede vir die verhoogde groeitempo van G. stearothermophilus van spore is onduidelik, maar hierdie metings beklemtoon die belangstelling van LA-HTM en werk op die enkelselvlak (of op die enkel mCFU-vlak) om meer te wete te kom oor die dinamika van sellewe .
Om die veelsydigheid van LA-HTM en sy werkverrigting by hoë temperature verder te demonstreer, het ons die groei van Sulfolobus shibatae, 'n hipertermofiele asidofiele archaea met 'n optimum groeitemperatuur van 80°C51, ondersoek. In vergelyking met G. stearothermophilus, het hierdie archaea ook 'n heel ander morfologie, wat lyk soos 1 mikron-sfere (kokke) eerder as langwerpige stawe (basille).
Figuur 7a bestaan uit opeenvolgende optiese diepte beelde van S. shibatae mCFU verkry met behulp van CGM (sien M7 speelfilm in Supplementary Materials). Hierdie mCFU groei teen ongeveer 73°C, onder die optimum temperatuur van 80°C, maar binne die temperatuurreeks vir aktiewe groei. Ons het verskeie splitsingsgebeure waargeneem wat mCFU's na 'n paar uur soos mikrodruiwe van archaea laat lyk het. Van hierdie OT-beelde is mCFU-biomassa oor tyd gemeet en in Figuur 7b aangebied. Interessant genoeg het S. shibatae mCFUs lineêre groei getoon eerder as die eksponensiële groei gesien met G. stearothermophilus mCFUs. Daar is 'n lang bespreking 52 oor die aard van selgroeitempo's: terwyl sommige studies groeitempo's van mikrobes rapporteer wat eweredig is aan hul grootte (eksponensiële groei), toon ander 'n konstante tempo (lineêre of bilineêre groei). Soos verduidelik deur Tzur et al.53, om te onderskei tussen eksponensiële en (bi)lineêre groei vereis 'n akkuraatheid van <6% in biomassa metings, wat buite bereik is vir die meeste QPM tegnieke, selfs wat interferometrie behels. Soos verduidelik deur Tzur et al.53, om te onderskei tussen eksponensiële en (bi)lineêre groei vereis 'n akkuraatheid van <6% in biomassa metings, wat buite bereik is vir die meeste QPM tegnieke, selfs wat interferometrie behels. Hoe om te verseker Цур и др.53, различение экспоненциального en (vir) линейного роста требует точности, met <6% koers достижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Soos verduidelik deur Zur et al.53, om te onderskei tussen eksponensiële en (bi)lineêre groei vereis <6% akkuraatheid in biomassa metings, wat onbereikbaar is vir die meeste QPM metodes, selfs met behulp van interferometrie.Soos verduidelik deur Zur et al. 53, om te onderskei tussen eksponensiële en (bi)lineêre groei vereis minder as 6% akkuraatheid in biomassa metings, wat onbereikbaar is vir die meeste QPM metodes, selfs wanneer interferometrie gebruik word. CGM bereik hierdie akkuraatheid met sub-pg akkuraatheid in biomassa metings36,48.
'n Tydsverloop wat bestaan uit 6 OT-beelde (olie-onderdompeling, 60x, NA-doelwit 1.25) en (b) mikro-CFU-biomassa-evolusie gemeet met CGM. Sien fliek M7 vir meer inligting.
Die perfek lineêre groei van S. shibatae was onverwags en is nog nie gerapporteer nie. Eksponensiële groei word egter verwag, ten minste omdat met verloop van tyd veelvuldige verdelings van 2, 4, 8, 16 … selle moet plaasvind. Ons het veronderstel dat lineêre groei te wyte kan wees aan sel-inhibisie as gevolg van digte selpakking, net soos selgroei verlangsaam en uiteindelik 'n dormante toestand bereik wanneer seldigtheid te hoog is.
Ons sluit af deur die volgende vyf punte van belang om die beurt te bespreek: vermindering in verhittingsvolume, vermindering in termiese traagheid, belangstelling in goue nanopartikels, belangstelling in kwantitatiewe fasemikroskopie, en 'n moontlike temperatuurreeks waarin LA-HTM gebruik kan word.
In vergelyking met weerstandsverhitting, bied laserverhitting wat vir HTM-ontwikkeling gebruik word verskeie voordele, wat ons in hierdie studie illustreer. In die besonder, in vloeibare media in die gesigsveld van die mikroskoop, word die verhittingsvolume binne 'n paar (10 μm) 3 volumes gehou. Op hierdie manier is slegs die waargenome mikrobes aktief, terwyl ander bakterieë dormant is en gebruik kan word om die monster verder te bestudeer – dit is nie nodig om die monster te verander elke keer as 'n nuwe temperatuur nagegaan moet word nie. Boonop laat mikroskaalverhitting direkte ondersoek van 'n groot reeks temperature toe: Figuur 4c is verkry uit 'n 3-uur film (Movie M3), wat gewoonlik die voorbereiding en ondersoek van verskeie monsters vereis – een vir elk van die monsters wat bestudeer word. y is die temperatuur wat die aantal dae in die eksperiment verteenwoordig. Die vermindering van die verhitte volume hou ook al die omliggende optiese komponente van die mikroskoop, veral die objektieflens, by kamertemperatuur, wat 'n groot probleem was wat die gemeenskap tot dusver in die gesig gestaar het. LA-HTM kan met enige lens gebruik word, insluitend oliedompellense, en sal by kamertemperatuur bly selfs met uiterste temperature in die gesigsveld. Die hoofbeperking van die laserverhittingsmetode wat ons in hierdie studie rapporteer, is dat selle wat nie heg of dryf nie ver van die gesigsveld af kan wees en moeilik om te bestudeer kan wees. 'n Oplossing kan wees om lense met 'n lae vergroting te gebruik om 'n groter temperatuurstyging van meer as 'n paar honderd mikron te bereik. Hierdie versigtigheid gaan gepaard met 'n afname in ruimtelike resolusie, maar as die doel is om die beweging van mikroörganismes te bestudeer, word hoë ruimtelike resolusie nie vereis nie.
Die tydskaal vir verhitting (en verkoeling) van die stelsel \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) hang af van sy grootte, volgens die wet \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), waar \ (L\ ) is die kenmerkende grootte van die hittebron (die deursnee van die laserstraal in ons studie is \(L\ ongeveer 100\) μm), \(D\) is die termiese diffusiwiteit van die omgewing (gemiddeld in ons kas, glas en water Diffusietempo\(D\ ongeveer 2\voudig {10}^{-7}\) m2/s Daarom, in hierdie studie, tydreaksies van die orde van 50 ms, dit wil sê, kwasi-oombliklik). temperatuurveranderinge, kan verwag word. Hierdie oombliklike vasstelling van temperatuurstyging verkort nie net die duur van die eksperiment nie, maar laat ook presiese tydsberekening \(t=0\) toe vir enige dinamiese studie van temperatuureffekte.
Ons voorgestelde metode is van toepassing op enige ligabsorberende substraat (byvoorbeeld kommersiële monsters met ITO-bedekking). Goue nanopartikels is egter in staat om hoë absorpsie in die infrarooi en lae absorpsie in die sigbare reeks te verskaf, waarvan laasgenoemde kenmerke van belang is vir effektiewe optiese waarneming in die sigbare reeks, veral wanneer fluoressensie gebruik word. Boonop is goud bioversoenbaar, chemies inert, optiese digtheid kan van 530 nm tot naby infrarooi aangepas word, en monstervoorbereiding is eenvoudig en ekonomies29.
Transversale roostergolffrontmikroskopie (CGM) laat nie net temperatuurkartering op mikroskaal toe nie, maar ook biomassamonitering, wat dit besonder nuttig maak (indien nie nodig nie) in kombinasie met LA-HTM. Oor die afgelope dekade is ander temperatuurmikroskopietegnieke ontwikkel, veral op die gebied van biobeelding, en die meeste daarvan vereis die gebruik van temperatuursensitiewe fluoresserende probes54,55. Hierdie metodes is egter gekritiseer en sommige verslae het onrealistiese temperatuurveranderinge binne selle gemeet, moontlik as gevolg van die feit dat fluoressensie van baie ander faktore as temperatuur afhang. Daarbenewens is die meeste fluoresserende probes onstabiel by hoë temperature. Daarom verteenwoordig QPM en veral CGM 'n ideale temperatuurmikroskopie tegniek vir die bestudering van lewe by hoë temperature met behulp van optiese mikroskopie.
Studies van S. shibatae, wat optimaal by 80°C leef, toon dat LA-HTM aangewend kan word om hipertermofiele te bestudeer, nie net eenvoudige termofiele nie. In beginsel is daar geen beperking op die reeks temperature wat met LA-HTM bereik kan word nie, en selfs temperature bo 100°C kan by atmosferiese druk bereik word sonder om te kook, soos gedemonstreer deur ons groep van 38 in hidrotermiese chemie-toepassings by atmosferiese druk A. 'n Laser word gebruik om goue nanopartikels 40 op dieselfde manier te verhit. Dus, LA-HTM het die potensiaal om gebruik te word om ongekende hipertermofiele waar te neem met standaard hoë resolusie optiese mikroskopie onder standaard toestande (dws onder omgewingstres).
Alle eksperimente is uitgevoer met behulp van 'n tuisgemaakte mikroskoop, insluitend Köhler-beligting (met LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), monsterhouer met handmatige xy-beweging, objektiewe (Olympus, 60x, 0.7 NA, lug, LUCPlanFLN60X of 60x, Oil NA, 1.25NA , UPLFLN60XOI), CGM-kamera (QLSI-kruisrooster, 39 µm-afstand, 0,87 mm vanaf Andor Zyla-kamerasensor) om intensiteit en golffrontbeelding te verskaf, en sCMOS-kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bis-modus, van Hamamatsu) om die data getoon in Figuur 5 (bakteriese swem). Die dichroïese straalverdeler is 'n 749 nm BrightLine-rand (Semrock, FF749-SDi01). Die filter aan die voorkant van die kamera is 'n 694 kort deurlaatfilter (FF02-694/SP-25, Semrock). Titaansaffierlaser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, gepompte tsoenami-laserholte, Spectra-Fisika in Fig. 2-5, verder vervang deur Millenia-laser, Spectraphysics 10 W, gepompte Mira-laserholte, Koherent, vir Fig. 2 -5). 6 en 7) is ingestel op die golflengte \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, wat ooreenstem met die plasmonresonansiespektrum van goue nanopartikels. Ruimtelike ligmodulators (1920 × 1152 pixels) is gekoop van Meadowlark Optics.
Kruisroostergolffrontmikroskopie (CGM) is 'n optiese mikroskopietegniek wat gebaseer is op die kombinasie van 'n tweedimensionele diffraksierooster (ook bekend as kruisrooster) op 'n afstand van een millimeter vanaf 'n konvensionele kamera se sensor. Die mees algemene voorbeeld van 'n CGM wat ons in hierdie studie gebruik het, word 'n vier-golflengte transversale verskuiwing interferometer (QLSI) genoem, waar die kruisrooster bestaan uit 'n intensiteit/fase ruitpatroon wat deur Primot et al. in 200034. Die vertikale en horisontale roosterlyne skep roosteragtige skaduwees op die sensor, waarvan die vervorming numeries in reële tyd verwerk kan word om die optiese golffrontvervorming (of ekwivalente faseprofiel) van die invallende lig te verkry. Wanneer dit op 'n mikroskoop gebruik word, kan 'n CGM-kamera die optiese padverskil van 'n afgebeelde voorwerp, ook bekend as optiese diepte (OT), met 'n sensitiwiteit van die orde van nanometers36 vertoon. In enige CGM-meting, om enige defekte in die optiese komponente of balke uit te skakel, moet 'n primêre verwysing OT-beeld geneem word en van enige daaropvolgende beelde afgetrek word.
Temperatuurmikroskopie is uitgevoer met behulp van 'n CGM-kamera soos beskryf in die verwysing. 32. Kortom, verhitting van 'n vloeistof verander sy brekingsindeks, wat 'n termiese lenseffek skep wat die invallende straal vervorm. Hierdie golffrontvervorming word deur die CGM gemeet en verwerk met behulp van 'n dekonvolusie-algoritme om 'n driedimensionele temperatuurverspreiding in die vloeibare medium te verkry. As die goue nanopartikels eweredig deur die monster versprei is, kan temperatuurkartering in bakterieëvrye gebiede gedoen word om beter beelde te produseer, wat ons soms doen. Die verwysing CGM-beeld is verkry sonder verhitting (met die laser af) en daarna op dieselfde plek in die beeld vasgelê met die laser aan.
Droëmassameting word bereik met dieselfde CGM-kamera wat vir temperatuurbeelding gebruik word. CGM verwysingsbeelde is verkry deur die monster vinnig in x en y te beweeg tydens blootstelling as 'n middel om enige inhomogeniteit in die OT as gevolg van die teenwoordigheid van bakterieë te gemiddelde. Uit OT-beelde van bakterieë is hul biomassa verkry deur gebruik te maak van 'n ensemble van beelde oor gebiede wat gekies is deur Matlab se tuisgemaakte segmenteringsalgoritme (sien onderafdeling "Numeriese kode"), volgens die prosedure beskryf in ref. 48. Kortliks, ons gebruik die verhouding \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), waar \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) die optiese dieptebeeld is, \(m\) is die droë gewig en \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) is 'n konstante. Ons het \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg gekies, wat 'n tipiese konstante vir lewende selle is.
’n Dekstrokie 25 mm in deursnee en 150 µm dik bedek met goue nanopartikels is in ’n AttofluorTM-kamer (Thermofisher) geplaas met die goue nanopartikels na bo. Geobacillus stearothermophilus is oornag voorgekweek in LB-medium (200 rpm, 60°C) voor elke dag van eksperimente. 'n Druppel van 5 µl van 'n suspensie van G. stearothermophilus met 'n optiese digtheid (OD) van 0.3 tot 0.5 is op 'n dekstrokie met goue nanopartikels geplaas. Daarna is 'n ronde dekstrokie 18 mm in deursnee met 'n gat 5 mm in deursnee in die middel op die druppel laat val, en 5 μl bakteriese suspensie met dieselfde optiese digtheid is herhaaldelik in die middel van die gat toegedien. Die putte op dekstrokies is voorberei in ooreenstemming met die prosedure beskryf in ref. 45 (sien aanvullende inligting vir meer inligting). Voeg dan 1 ml LB-medium by die dekstrokie om te keer dat die vloeistoflaag uitdroog. Die laaste dekglans word oor die geslote deksel van die Attofluor™-kamer geplaas om verdamping van die medium tydens inkubasie te voorkom. Vir ontkiemingseksperimente het ons spore gebruik, wat na konvensionele eksperimente soms die boonste dekstrook bedek het. 'n Soortgelyke metode is gebruik om Sulfolobus shibatae te verkry. Drie dae (200 rpm, 75°C) van voorlopige bewerking van Thiobacillus serrata is in medium 182 (DSMZ) uitgevoer.
Monsters van goue nanopartikels is voorberei deur micellêre blokkopolimerlitografie. Hierdie proses word in detail beskryf in hfst. 60. Kortliks, miselle wat goudione inkapsel is gesintetiseer deur die kopolimeer met HAuCl4 in tolueen te meng. Die skoongemaakte dekstrokies is dan in die oplossing gedompel en met UV-bestraling in die teenwoordigheid van 'n reduseermiddel behandel om goue sade te verkry. Laastens is goue sade gekweek deur 'n dekglans met 'n waterige oplossing van KAuCl4 en etanolamien vir 16 minute in aanraking te bring, wat gelei het tot 'n kwasi-periodieke en baie eenvormige rangskikking van nie-sferiese goue nanopartikels in die nabye infrarooi.
Om die interferogramme na OT-beelde om te skakel, het ons 'n tuisgemaakte algoritme gebruik, soos uiteengesit in die skakel. 33 en is beskikbaar as 'n Matlab-pakket in die volgende publieke bewaarplek: https://github.com/baffou/CGMprocess. Die pakket kan intensiteit en OT-beelde bereken op grond van aangetekende interferogramme (insluitend verwysingsbeelde) en kamera-skikkingafstande.
Om die fasepatroon wat op SLM toegepas is te bereken om 'n gegewe temperatuurprofiel te verkry, het ons 'n voorheen ontwikkelde tuisgemaakte algoritme39,42 gebruik wat beskikbaar is in die volgende publieke bewaarplek: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Die invoer is die gewenste temperatuurveld, wat digitaal of via 'n monochroom bmp-beeld ingestel kan word.
Om die selle te segmenteer en hul droë gewig te meet, het ons ons Matlab-algoritme gebruik wat in die volgende openbare bewaarplek gepubliseer is: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Op elke prent moet die gebruiker op die bakterieë of mCFU van belang klik, die towerstafsensitiwiteit aanpas en die keuse bevestig.
Vir meer inligting oor studie-ontwerp, sien die Natuurnavorsingsverslag-abstrak wat aan hierdie artikel gekoppel is.
Data wat die resultate van hierdie studie ondersteun, is op redelike versoek by die onderskeie outeurs beskikbaar.
Die bronkode wat in hierdie studie gebruik word, word in die Metodes-afdeling uiteengesit, en ontfoutweergawes kan afgelaai word vanaf https://github.com/baffou/ in die volgende bewaarplekke: SLM_temperatureShaping, CGMprocess en CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insig in termofiele en hul wye-spektrum toepassings. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insig in termofiele en hul wye-spektrum toepassings.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. en Sharma, AK Oorsig van termofiele en hul wye toepassing. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. en Sharma AK 'n Diep begrip van termofiele en 'n wye reeks toepassings.3 Biotegnologie 6, 81 (2016).
Postyd: 26 September 2022