Alzheimer se siekte (AD) het nie proteïenbiomerkers nie wat sy veelvuldige onderliggende patofisiologie weerspieël, wat die vordering van diagnose en behandeling belemmer. Hier gebruik ons omvattende proteomika om serebrospinale vloeistof (CSF) biomerkers te identifiseer wat 'n wye reeks AD patofisiologie verteenwoordig. Multipleks massaspektrometrie het onderskeidelik ongeveer 3 500 en ongeveer 12 000 proteïene in AD CSF en die brein geïdentifiseer. Die netwerkanalise van die breinproteoom het 44 biodiversiteitsmodules opgelos, waarvan 15 met die serebrospinale vloeistofproteoom oorvleuel het. Die CSF AD merkers in hierdie oorvleuelende modules word in vyf proteïengroepe gevou, wat verskillende patofisiologiese prosesse verteenwoordig. Die sinapse en metaboliete in die AD-brein neem af, maar die CSF neem toe, terwyl die glia-ryke miëlinasie en immuungroepe in die brein en CSF toeneem. Die konsekwentheid en siektespesifisiteit van die paneelveranderinge is in meer as 500 bykomende SSV-monsters bevestig. Hierdie groepe het ook biologiese subgroepe in asimptomatiese AD geïdentifiseer. Oor die algemeen is hierdie resultate 'n belowende stap in die rigting van webgebaseerde biomerker-instrumente vir kliniese toepassings in AD.
Alzheimer se siekte (AD) is die mees algemene oorsaak van neurodegeneratiewe demensie wêreldwyd en word gekenmerk deur 'n wye reeks biologiese sisteem disfunksies, insluitend sinaptiese oordrag, gliale-gemedieerde immuniteit en mitochondriale metabolisme (1-3). Sy gevestigde proteïenbiomerkers fokus egter steeds op die opsporing van amiloïed- en tau-proteïen, en kan dus nie hierdie diverse patofisiologie weerspieël nie. Hierdie "kern" proteïen biomerkers wat die mees betroubare gemeet word in serebrospinale vloeistof (CSF) sluit in (i) amyloïed beta peptied 1-42 (Aβ1-42), wat die vorming van kortikale amiloïed gedenkplate weerspieël; (ii) totale tau, 'n teken van aksondegenerasie; (iii) fosfo-tau (p-tau), 'n verteenwoordiger van patologiese tau-hiperfosforilering (4-7). Alhoewel hierdie serebrospinale vloeistof-biomerkers ons opsporing van "gemerkte" AD-proteïensiektes (4-7) aansienlik vergemaklik het, verteenwoordig hulle slegs 'n klein deel van die komplekse biologie agter die siekte.
Die gebrek aan patofisiologiese diversiteit van AD-biomerkers het gelei tot baie uitdagings, insluitend (i) die onvermoë om die biologiese heterogeniteit van AD-pasiënte te identifiseer en te kwantifiseer, (ii) onvoldoende meting van die erns en vordering van die siekte, veral in die prekliniese stadium, En ( iii) die ontwikkeling van terapeutiese middels wat nie daarin geslaag het om alle aspekte van neurologiese agteruitgang heeltemal op te los nie. Ons vertroue op landmerkpatologie om AD van verwante siektes te beskryf, vererger hierdie probleme net. Meer en meer bewyse toon dat die meeste bejaarde mense met demensie meer as een patologiese kenmerk van kognitiewe agteruitgang het (8). Soveel as 90% of meer van individue met AD-patologie het ook vaskulêre siekte, TDP-43-insluitings of ander degeneratiewe siektes (9). Hierdie hoë proporsies van patologiese oorvleueling het ons huidige diagnostiese raamwerk vir demensie ontwrig, en 'n meer omvattende patofisiologiese definisie van die siekte is nodig.
In die lig van die dringende behoefte aan 'n verskeidenheid AD-biomerkers, neem die veld toenemend die "omics"-metode aan wat gebaseer is op die algehele stelsel om biomerkers te ontdek. Die Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance is in 2014 van stapel gestuur en is aan die voorpunt van die program. Hierdie multidissiplinêre poging deur die Nasionale Instituut van Gesondheid, akademie en industrie het ten doel om stelselgebaseerde strategieë te gebruik om die patofisiologie van AD beter te definieer en biodiversiteit diagnostiese analise en behandelingstrategieë te ontwikkel (10). As deel van hierdie projek het netwerkproteomika 'n belowende hulpmiddel geword vir die bevordering van sisteemgebaseerde biomerkers in AD. Hierdie onbevooroordeelde data-gedrewe benadering organiseer komplekse proteomika-datastelle in groepe of "modules" van mede-uitgedrukte proteïene wat geassosieer word met spesifieke seltipes, organelle en biologiese funksies (11-13). Byna 12 inligtingryke netwerkproteomika-studies is op die AD-brein uitgevoer (13-23). Oor die algemeen dui hierdie ontledings aan dat die AD-breinnetwerkproteoom 'n hoogs bewaarde modulêre organisasie in onafhanklike kohorte en veelvuldige kortikale streke handhaaf. Daarbenewens toon sommige van hierdie modules reproduceerbare veranderinge in AD-verwante oorvloed oor datastelle, wat die patofisiologie van veelvuldige siektes weerspieël. Gesamentlik demonstreer hierdie bevindings 'n belowende ankerpunt vir die ontdekking van die breinnetwerkproteoom as 'n sisteemgebaseerde biomerker in AD.
Om die AD-breinnetwerkproteoom in klinies bruikbare sisteemgebaseerde biomerkers te transformeer, het ons die brein-afgeleide netwerk gekombineer met die proteomiese analise van AD CSF. Hierdie geïntegreerde benadering het gelei tot die identifikasie van vyf belowende stelle CSF-biomerkers wat geassosieer word met 'n wye reeks breingebaseerde patofisiologie, insluitend sinapse, bloedvate, miëlinasie, inflammasie en disfunksie van metaboliese weë. Ons het hierdie biomerkerpanele suksesvol bekragtig deur middel van veelvuldige replikasie-ontledings, insluitend meer as 500 CSF-monsters van verskeie neurodegeneratiewe siektes. Hierdie bekragtigingsontledings sluit in die ondersoek van groepteikens in die SSV van pasiënte met asimptomatiese AD (AsymAD) of om bewyse te toon van abnormale amiloïedophoping in 'n normale kognitiewe omgewing. Hierdie ontledings beklemtoon die beduidende biologiese heterogeniteit in die AsymAD-populasie en identifiseer paneelmerkers wat moontlik individue in die vroegste stadiums van die siekte kan subtipeer. Oor die algemeen verteenwoordig hierdie resultate 'n sleutelstap in die ontwikkeling van proteïenbiomerker-instrumente gebaseer op veelvuldige stelsels wat baie van die kliniese uitdagings wat AD in die gesig staar, suksesvol kan oplos.
Die hoofdoel van hierdie studie is om nuwe serebrospinale vloeistof-biomerkers te identifiseer wat verskeie breingebaseerde patofisiologie weerspieël wat tot AD lei. Figuur S1 skets ons navorsingsmetodologie, wat insluit (i) 'n omvattende analise gedryf deur voorlopige bevindinge van AD CSF en die netwerkbreinproteoom om verskeie breinverwante CSF-siekte biomerkers te identifiseer, en (ii) daaropvolgende replikasie Hierdie biomerkers is in verskeie onafhanklike serebrospinale vloeibare kohorte. Die ontdekking-georiënteerde navorsing het begin met die ontleding van die differensiële uitdrukking van CSF in 20 kognitief normale individue en 20 AD pasiënte by Emory Goizueta Alzheimer se siekte Navorsingsentrum (ADRC). Die diagnose van AD word gedefinieer as 'n beduidende kognitiewe inkorting in die teenwoordigheid van lae Aβ1-42 en verhoogde vlakke van totale tau en p-tau in die serebrospinale vloeistof [Gemiddelde Montreal Kognitiewe Assessering (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (Tabel S1A). Die kontrole (gemiddelde MoCA, 26.7 ± 2.2) het normale vlakke van CSF-biomerkers gehad.
Menslike CSF word gekenmerk deur 'n dinamiese reeks proteïenoorvloed, waarin albumien en ander uiters volop proteïene die opsporing van proteïene van belang kan voorkom (24). Om die diepte van proteïenontdekking te verhoog, het ons die eerste 14 hoogs volop proteïene uit elke CSF-monster verwyder voor massaspektrometrie (MS)-analise (24). 'n Totaal van 39 805 peptiede is deur MS geïdentifiseer, wat na 3691 proteome in 40 monsters gekarteer is. Proteïenkwantifisering word uitgevoer deur meervoudige tandemmassamerker (TMT)-etikettering (18, 25). Om die ontbrekende data op te los, het ons slegs daardie proteïene ingesluit wat in ten minste 50% van die monsters gekwantifiseer is in die daaropvolgende analise, en sodoende uiteindelik 2875 proteome gekwantifiseer. As gevolg van die beduidende verskil in totale proteïen oorvloed vlakke, is 'n kontrole monster statisties beskou as 'n uitskieter (13) en is nie ingesluit in die daaropvolgende analise. Die oorvloedwaardes van die oorblywende 39 monsters is aangepas volgens ouderdom, geslag en bondelkovariansie (13-15, 17, 18, 20, 26).
Met behulp van statistiese t-toets analise om differensiële uitdrukking op die regressie datastel te evalueer, het hierdie analise proteïene geïdentifiseer waarvan die oorvloed vlakke aansienlik verander is (P <0.05) tussen die kontrole en AD gevalle (Tabel S2A). Soos getoon in Figuur 1A, is die oorvloed van 'n totaal van 225 proteïene in AD aansienlik verminder, en die oorvloed van 303 proteïene is aansienlik verhoog. Hierdie differensieel uitgedrukte proteïene sluit verskeie voorheen geïdentifiseerde serebrospinale vloeistof AD merkers in, soos mikrotubuli-geassosieerde proteïen tau (MAPT; P = 3.52 × 10−8), neurofilament (NEFL; P = 6.56 × 10−3), groeiverwante proteïen 43 (GAP43; P = 1.46 × 10−5), Vetsuurbindende Proteïen 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Chitinase 3 soos 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), Neurale Granulien (NRGN; P = 3.43 × 10−4) en VGF senuweegroeifaktor (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). Ons het egter ook ander baie belangrike teikens geïdentifiseer, soos BBP-dissosiasie-inhibeerder 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) en SPARC-verwante modulêre kalsiumbinding 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). Gene Ontologie (GO) analise van 225 aansienlik verminderde proteïene het noue verbande met liggaamsvloeistofprosesse soos steroïedmetabolisme, bloedstolling en hormoonaktiwiteit aan die lig gebring (Figuur 1B en Tabel S2B). Daarteenoor is die aansienlik verhoogde proteïen van 303 nou verwant aan selstruktuur en energiemetabolisme.
(A) Die vulkaanplot toon die log2-vouverandering (x-as) relatief tot die -log10 statistiese P-waarde (y-as) verkry deur die t-toets, wat gebruik word om differensiële uitdrukking tussen die kontrole (CT) en AD gevalle van die CSF-proteoom Van alle proteïene. Proteïene met aansienlik verlaagde vlakke (P <0.05) in AD word in blou getoon, terwyl proteïene met aansienlik verhoogde vlakke in siekte in rooi getoon word. Die geselekteerde proteïen is gemerk. (B) Die top GO-terme wat met proteïen verband hou, is aansienlik verminder (blou) en verhoog (rooi) in AD. Toon die drie GO-terme met die hoogste z-tellings in die velde van biologiese prosesse, molekulêre funksies en sellulêre komponente. (C) MS het MAPT-vlak in CSF-monster (links) gemeet en die korrelasie daarvan met monster ELISA tau-vlak (regs). Die Pearson-korrelasiekoëffisiënt met die relevante P-waarde word vertoon. Weens die gebrek aan ELISA-data vir een AD-geval, bevat hierdie syfers waardes vir 38 van die 39 geanaliseerde gevalle. (D) Trosontleding onder toesig (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) aangepas P <0.01) op die kontrole en AD CSF het monsters gevind deur die 65 mees betekenisvol veranderde proteïene in die datastel te gebruik. Standaardiseer, normaliseer.
Die proteomiese vlak van MAPT is nou verwant aan die onafhanklik gemete ELISA-tau-vlak (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Figuur 1C), wat die geldigheid van ons MS-meting ondersteun. Na tripsienvertering op die vlak van amiloïed-voorloperproteïen (APP), kan die isovorm-spesifieke peptiede wat na die C-terminus van Aβ1-40 en Aβ1-42 gekarteer is, nie doeltreffend geïoniseer word nie (27, 28). Daarom het die APP-peptiede wat ons geïdentifiseer het niks te doen met ELISA Aβ1-42-vlakke nie. Ten einde die differensiële uitdrukking van elke geval te evalueer, het ons differensieel uitgedrukte proteïene met P <0.0001 [vals ontdekkingskoers (FDR) gekorrigeer P <0.01] gebruik om 'n trosontleding onder toesig van die monsters uit te voer (Tabel S2A). Soos getoon in Figuur 1D, kan hierdie 65 hoogs betekenisvolle proteïene monsters korrek groepeer volgens siektetoestand, behalwe vir een AD geval met kontrole-agtige eienskappe. Van hierdie 65 proteïene het 63 in AD toegeneem, terwyl slegs twee (CD74 en ISLR) afgeneem het. In totaal het hierdie serebrospinale vloeistofontledings honderde proteïene in AD geïdentifiseer wat as siektebiomerkers kan dien.
Toe het ons 'n onafhanklike netwerkanalise van die AD-breinproteoom uitgevoer. Die breinkohort van hierdie ontdekking het dorsolaterale prefrontale korteks (DLPFC) van beheer (n = 10), Parkinson se siekte (PD; n = 10), gemengde AD/PD (n = 10) en AD (n = 10) gevalle ingesluit. ) Voorbeeld. Emery Goizueta ADRC. Die demografie van hierdie 40 gevalle is voorheen beskryf (25) en word in Tabel S1B opgesom. Ons het TMT-MS gebruik om hierdie 40 breinweefsels en die replikasie-kohort van 27 gevalle te ontleed. In totaal het hierdie twee breindatastelle 227 121 unieke peptiede geproduseer, wat na 12 943 proteome gekarteer is (25). Slegs daardie proteïene wat in ten minste 50% van gevalle gekwantifiseer is, is by daaropvolgende ondersoeke ingesluit. Die finale ontdekkingsdatastel bevat 8817 gekwantifiseerde proteïene. Pas proteïenoorvloedvlakke aan gebaseer op ouderdom, geslag en nadoodse interval (PMI). Die differensiële uitdrukkingsanalise van die datastel na regressie het getoon dat >2000 proteïenvlakke betekenisvol verander is [P <0.05, variansieanalise (ANOVA)] in twee of meer siektekohorte. Toe het ons 'n trosanalise onder toesig uitgevoer gebaseer op die differensieel uitgedrukte proteïene, en P <0.0001 in AD / kontrole en / of AD / PD vergelykings (Figuur S2, A en B, Tabel S2C). Hierdie 165 hoogs veranderde proteïene beeld gevalle met AD-patologie duidelik uit die kontrole- en PD-monsters uit, wat die sterk AD-spesifieke veranderinge in die hele proteoom bevestig.
Ons het toe 'n algoritme genaamd Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) gebruik om netwerkanalise op die ontdekte breinproteoom uit te voer, wat die datastel in proteïenmodules met soortgelyke uitdrukkingspatrone organiseer (11-13). Die analise het 44 modules (M) mede-uitgedrukte proteïene geïdentifiseer, gesorteer en genommer van die grootste (M1, n = 1821 proteïene) tot die kleinste (M44, n = 34 proteïene) (Figuur 2A en Tabel S2D) ). Soos hierbo genoem (13) Bereken die verteenwoordigende uitdrukkingsprofiel of kenmerkende proteïen van elke module, en korreleer dit met die siektetoestand en AD-patologie, dit wil sê, vestig die alliansie van Alzheimer-siekteregister (CERAD) en Braak-telling (Figuur 2B). In die geheel was 17 modules beduidend verwant aan AD neuropatologie (P <0.05). Baie van hierdie siekteverwante modules is ook ryk aan seltipe-spesifieke merkers (Figuur 2B). Soos hierbo genoem (13), word seltipe-verryking bepaal deur die module-oorvleueling en die verwysingslys van seltipe-spesifieke gene te ontleed. Hierdie gene is afgelei van gepubliseerde data in geïsoleerde muisneurone, endoteel- en gliale selle. RNA-volgordebepaling (RNA-volgorde) eksperiment (29).
(A) Ontdek die WGCNA van die breinproteoom. (B) Tweegewig middelkorrelasie (BiCor) analise van die modulêre handtekeningproteïen (die eerste hoofkomponent van modulêre proteïenuitdrukking) met AD neuropatologiese kenmerke (bo), insluitend CERAD (Aβ gedenkplaat) en Braak (tau tangles) tellings. Die intensiteite van positiewe (rooi) en negatiewe (blou) korrelasies word deur 'n tweekleur-hittekaart getoon, en sterretjies dui statistiese betekenisvolheid aan (P <0.05). Gebruik Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (onder) om die seltipe assosiasie van elke proteïenmodule te assesseer. Die intensiteit van die rooi skakering dui die mate van seltipe verryking aan, en die asterisk dui statistiese betekenisvolheid aan (P <0,05). Gebruik die BH-metode om die P-waarde wat van die VOO verkry is, reg te stel. (C) GO-analise van modulêre proteïene. Die mees verwante biologiese prosesse word vir elke module of verwante modulegroep getoon. oligo, oligodendrosiet.
'n Stel van vyf nouverwante astrosiet- en mikroglia-ryke modules (M30, M29, M18, M24 en M5) het 'n sterk positiewe korrelasie met AD neuropatologie getoon (Figuur 2B). Ontologie-analise verbind hierdie gliale modules met selgroei, proliferasie en immuniteit (Figuur 2C en Tabel S2E). Twee bykomende gliale modules, M8 en M22, word ook sterk opgereguleer in siekte. M8 is hoogs verwant aan die Tol-agtige reseptor pad, 'n seinkaskade wat 'n sleutelrol speel in die aangebore immuunrespons (30). Terselfdertyd is M22 nou verwant aan post-translasionele wysiging. M2, wat ryk is aan oligodendrosiete, toon 'n sterk positiewe korrelasie met AD patologie en 'n ontologiese verband met nukleosied sintese en DNA replikasie, wat dui op verbeterde sel proliferasie in siektes. In die algemeen ondersteun hierdie bevindings die hoogte van gliale modules wat ons voorheen in die AD-netwerkproteoom waargeneem het (13, 17). Daar word tans gevind dat baie AD-verwante gliale modules in die netwerk laer uitdrukkingsvlakke in beheer- en PD-gevalle toon, wat hul siektespesifisiteit beklemtoon wat in AD verhoog is (Figuur S2C).
Slegs vier modules in ons netwerkproteoom (M1, M3, M10 en M32) is sterk negatief gekorreleer met AD-patologie (P <0.05) (Figuur 2, B en C). Beide M1 en M3 is ryk aan neuronale merkers. M1 is hoogs verwant aan sinaptiese seine, terwyl M3 nou verwant is aan mitochondriale funksie. Daar is geen bewyse van seltipe verryking vir M10 en M32 nie. M32 weerspieël die verband tussen M3 en selmetabolisme, terwyl M10 hoogs verwant is aan selgroei en mikrotubulusfunksie. In vergelyking met AD, is al vier modules verhoog in beheer en PD, wat aan hulle siekte-spesifieke AD veranderinge gee (Figuur S2C). Oor die algemeen ondersteun hierdie resultate die verminderde oorvloed van neuronryke modules wat ons voorheen in AD waargeneem het (13, 17). Samevattend, die netwerkanalise van die breinproteoom wat ons ontdek het, het AD-spesifiek veranderde modules geproduseer wat ooreenstem met ons vorige bevindings.
AD word gekenmerk deur 'n vroeë asimptomatiese stadium (AsymAD), waarin individue amiloïedophoping vertoon sonder kliniese kognitiewe agteruitgang (5, 31). Hierdie asimptomatiese stadium verteenwoordig 'n kritieke venster vir vroeë opsporing en intervensie. Ons het voorheen sterk modulêre bewaring van AsymAD- en AD-breinnetwerkproteoom oor onafhanklike datastelle getoon (13, 17). Om te verseker dat die breinnetwerk wat ons tans ontdek is in ooreenstemming met hierdie vorige bevindings is, het ons die bewaring van 44 modules in die gerepliseerde datastel van 27 DLPFC-organisasies ontleed. Hierdie organisasies sluit beheer (n = 10), AsymAD (n = 8) en AD (n = 9) gevalle in. Kontrole- en AD-monsters is ingesluit in die ontleding van ons ontdekkingsbreinkohort (Tabel S1B), terwyl AsymAD-gevalle slegs uniek was in die replikasie-kohort. Hierdie AsymAD-gevalle het ook van die Emory Goizueta ADRC-breinbank gekom. Alhoewel kognisie normaal was ten tyde van die dood, was amiloïedvlakke abnormaal hoog (gemiddelde CERAD, 2.8 ± 0.5) (Tabel S1B).
TMT-MS-analise van hierdie 27 breinweefsels het gelei tot die kwantifisering van 11 244 proteome. Hierdie finale telling sluit slegs daardie proteïene in wat in ten minste 50% van die monsters gekwantifiseer is. Hierdie gerepliseerde datastel bevat 8638 (98.0%) van die 8817 proteïene wat in ons ontdekking breinanalise opgespoor is, en het byna 3000 aansienlik veranderde proteïene tussen die kontrole- en AD-kohorte (P <0.05, na Tukey se gepaarde t-toets vir variansieanalise) ( Tabel S2F). Onder hierdie differensieel uitgedrukte proteïene het 910 ook beduidende vlakveranderinge tussen AD en breinproteoombeheergevalle getoon (P <0.05, na ANOVA Tukey-gepaarde t-toets). Dit is opmerklik dat hierdie 910 merkers hoogs konsekwent is in die rigting van verandering tussen proteome (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Figuur S3A). Onder die verhoogde proteïene is die proteïene met die mees konsekwente veranderinge tussen datastelle hoofsaaklik lede van die gliale-ryke M5- en M18-modules (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 en GFAP). Onder die verminderde proteïene was diegene met die mees konsekwente veranderinge byna uitsluitlik lede van die M1-module (NPTX2, VGF en RPH3A) wat met die sinaps geassosieer word. Ons het verder die AD-verwante veranderinge van midkine (MDK), CD44, afgeskei frizzled-verwante proteïen 1 (SFRP1) en VGF geverifieer deur western blotting (Figuur S3B). Module-bewaringsanalise het getoon dat ongeveer 80% van die proteïenmodules (34/44) in die breinproteoom aansienlik bewaar is in die replikasiedatastel (z-telling> 1.96, FDR gekorrigeer P <0.05) (Figuur S3C). Veertien van hierdie modules is spesiaal tussen die twee proteome gereserveer (z-telling> 10, FDR gekorrigeer P <1.0 × 10−23). Oor die algemeen beklemtoon die ontdekking en replikasie van die hoë mate van konsekwentheid in differensiële uitdrukking en modulêre samestelling tussen die breinproteoom die reproduceerbaarheid van die veranderinge in AD frontale korteksproteïene. Daarbenewens het dit ook bevestig dat AsymAD en meer gevorderde siektes 'n baie soortgelyke breinnetwerkstruktuur het.
'n Meer gedetailleerde ontleding van die differensiële uitdrukking in die breinreplikasie-datastel beklemtoon die beduidende mate van AsymAD-proteïenveranderinge, insluitend 'n totaal van 151 aansienlik veranderde proteïene tussen AsymAD en die kontrole (P <0.05) (Figuur S3D). In ooreenstemming met die amiloïedlading het APP in die brein van AsymAD en AD aansienlik toegeneem. MAPT verander slegs aansienlik in AD, wat ooreenstem met verhoogde vlakke van tangles en die bekende korrelasie daarvan met kognitiewe agteruitgang (5, 7). Die gliale-ryke modules (M5 en M18) word hoogs weerspieël in die verhoogde proteïene in AsymAD, terwyl die neuronverwante M1-module die mees verteenwoordigende is van die verminderde proteïene in AsymAD. Baie van hierdie AsymAD merkers toon groter veranderinge in simptomatiese siektes. Onder hierdie merkers is SMOC1, 'n gliale proteïen wat aan M18 behoort, wat geassosieer word met breingewasse en die ontwikkeling van oë en ledemate (32). MDK is 'n heparienbindende groeifaktor wat verband hou met selgroei en angiogenese (33), nog 'n lid van M18. In vergelyking met die kontrolegroep het AsymAD aansienlik toegeneem, gevolg deur 'n groter toename in AD. Daarteenoor is die sinaptiese proteïen neuropentraxin 2 (NPTX2) aansienlik verminder in die AsymAD-brein. NPTX2 was voorheen geassosieer met neurodegenerasie en het 'n erkende rol in die bemiddeling van opwindende sinapse (34). Algehele, hierdie resultate toon 'n verskeidenheid van verskillende prekliniese proteïen veranderinge in AD wat blyk te vorder met die erns van die siekte.
Gegewe dat ons 'n aansienlike diepte van proteïendekking bereik het in die ontdekking van die breinproteoom, probeer ons om die oorvleueling daarvan met die netwerkvlak AD-transkriptoom meer volledig te verstaan. Daarom het ons die breinproteoom wat ons ontdek het vergelyk met die module wat ons voorheen gegenereer het uit die mikroskikkingmeting van 18 204 gene in AD (n = 308) en beheer (n = 157) DLPFC-weefsels (13). oorvleuel. In totaal het ons 20 verskillende RNA-modules geïdentifiseer, waarvan baie die verryking van spesifieke seltipes gedemonstreer het, insluitend neurone, oligodendrosiete, astrosiete en mikroglia (Figuur 3A). Die veelvuldige veranderinge van hierdie modules in AD word in Figuur 3B getoon. In ooreenstemming met ons vorige proteïen-RNA-oorvleuelingsanalise deur gebruik te maak van die dieper ongemerkte MS-proteoom (ongeveer 3000 proteïene) (13), is die meeste van die 44 modules in die breinproteoomnetwerk wat ons gevind het in die transkriptoomnetwerk. Daar is geen noemenswaardige oorvleueling in nie. Selfs in ons ontdekking en replikasie van die 34 proteïenmodules wat hoogs in die breinproteoom behou word, het slegs 14 (~40%) die Fisher se presiese toets (FET) geslaag het bewys dat dit 'n statisties beduidende oorvleueling met die transkriptoom het (Figuur 3A). Versoenbaar met DNA-skadeherstel (P-M25 en P-M19), proteïentranslasie (P-M7 en P-M20), RNA-binding/splyting (P-M16 en P-M21) en proteïen-teikening (P-M13 en P- M23) oorvleuel nie met modules in die transkripsie nie. Daarom, alhoewel 'n dieper proteoom datastel gebruik word in die huidige oorvleueling analise (13), is die meeste van die AD netwerk proteoom nie gekarteer na die transkriptoom netwerk.
(A) Hipergeometriese VOO demonstreer die verryking van seltipe-spesifieke merkers in die RNA-module van die AD-transkriptoom (bo) en die mate van oorvleueling tussen die RNA (x-as) en proteïen (y-as) modules van die AD brein (onder). Die intensiteit van die rooi skakering dui op die mate van verryking van seltipes in die boonste paneel en die intensiteit van die oorvleueling van die modules in die onderste paneel. Sterretjies dui statistiese betekenisvolheid aan (P <0,05). (B) Die graad van korrelasie tussen die kenmerkende gene van elke transkriptoommodule en AD-status. Die modules aan die linkerkant is die negatiefste gekorreleer met AD (blou), en dié aan die regterkant is die mees positief gekorreleer met AD (rooi). Die log-getransformeerde BH-gekorrigeerde P-waarde dui die mate van statistiese betekenisvolheid van elke korrelasie aan. (C) Beduidende oorvleuelende modules met gedeelde seltipe verryking. (D) Korrelasie-analise van die log2 vou verandering van die gemerkte proteïen (x-as) en RNA (y-as) in die oorvleuelende module. Die Pearson-korrelasiekoëffisiënt met die relevante P-waarde word vertoon. Mikro, mikroglia; hemelliggame, astrasiete. CT, beheer.
Die meeste oorvleuelende proteïen- en RNA-modules deel soortgelyke seltipe-verrykingsprofiele en konsekwente AD-veranderingsrigtings (Figuur 3, B en C). Met ander woorde, die sinapsverwante M1-module van die breinproteoom (PM1) word gekarteer na drie neuronryke homoloë RNA-modules (R-M1, R-M9 en R-M16), wat in AD is. Beide het gewys 'n verlaagde vlak. Net so oorvleuel die gliale-ryke M5- en M18-proteïenmodules met RNA-modules wat ryk is aan astrosiete en mikroglia-merkers (R-M3, R-M7 en R-M10) en is hoogs betrokke by siektetoename. Hierdie gedeelde modulêre kenmerke tussen die twee datastelle ondersteun verder die seltipe verryking en siekteverwante veranderinge wat ons in die breinproteoom waargeneem het. Ons het egter baie beduidende verskille tussen die RNA- en proteïenvlakke van individuele merkers in hierdie gedeelde modules waargeneem. Korrelasie-analise van die differensiële uitdrukking van die proteomika en transkriptomika van die molekules binne hierdie oorvleuelende modules (Figuur 3D) beklemtoon hierdie inkonsekwentheid. Byvoorbeeld, APP en verskeie ander gliale module proteïene (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 en SFRP1) het 'n beduidende toename in die AD proteoom getoon, maar daar was byna geen verandering in die AD transkriptoom nie. Hierdie proteïen-spesifieke veranderinge kan nou verwant wees aan amiloïed gedenkplate (23, 35), wat die proteoom uitlig as die bron van patologiese veranderinge, en hierdie veranderinge word dalk nie in die transkripsie weerspieël nie.
Nadat ons die brein- en CSF-proteome wat ons ontdek het, onafhanklik ontleed het, het ons 'n omvattende ontleding van die twee datastelle gedoen om AD CSF-biomerkers te identifiseer wat verband hou met die patofisiologie van die breinnetwerk. Ons moet eers die oorvleueling van die twee proteome definieer. Alhoewel dit algemeen aanvaar word dat CSF neurochemiese veranderinge in die AD-brein weerspieël (4), is die presiese mate van oorvleueling tussen die AD-brein en die CSF-proteoom onduidelik. Deur die aantal gedeelde geenprodukte wat in ons twee proteome opgespoor is, te vergelyk, het ons gevind dat byna 70% (n = 1936) van die proteïene wat in die serebrospinale vloeistof geïdentifiseer is, ook in die brein gekwantifiseer is (Figuur 4A). Die meeste van hierdie oorvleuelende proteïene (n = 1721) word gekarteer na een van 44 mede-uitdrukkingsmodules uit die ontdekkingsbreindatastel (Figuur 4B). Soos verwag, het die ses grootste breinmodules (M1 tot M6) die grootste hoeveelheid CSF-oorvleueling getoon. Daar is egter kleiner breinmodules (byvoorbeeld M15 en M29) wat 'n onverwagse hoë mate van oorvleueling bereik, groter as 'n breinmodule wat twee keer sy grootte is. Dit motiveer ons om 'n meer gedetailleerde, statisties-gedrewe metode aan te neem om die oorvleueling tussen die brein en serebrospinale vloeistof te bereken.
(A en B) Die proteïene wat in die ontdekkingsbrein en CSF-datastelle opgespoor is, oorvleuel. Die meeste van hierdie oorvleuelende proteïene word geassosieer met een van die 44 ko-uitdrukkingsmodules van die breinko-uitdrukkingsnetwerk. (C) Ontdek die oorvleueling tussen die serebrospinale vloeistofproteoom en die breinnetwerkproteoom. Elke ry van die hittekaart verteenwoordig 'n aparte oorvleuelingsanalise van die hipergeometriese VOO. Die boonste ry beeld die oorvleueling (grys/swart skakering) tussen die breinmodule en die hele CSF-proteoom uit. Die tweede reël toon dat die oorvleueling tussen breinmodules en CSF-proteïen (geskakeer in rooi) aansienlik opgereguleer word in AD (P <0.05). Die derde ry toon dat die oorvleueling tussen breinmodules en CSF-proteïen (blou skakering) aansienlik afgereguleer word in AD (P <0.05). Gebruik die BH-metode om die P-waarde wat van die VOO verkry is, reg te stel. (D) Vou modulepaneel gebaseer op seltipe assosiasie en verwante GO-terme. Hierdie panele bevat 'n totaal van 271 breinverwante proteïene, wat betekenisvolle differensiële uitdrukking in die CSF-proteoom het.
Met behulp van enkelstert-VOO's het ons die belangrikheid van proteïenoorvleueling tussen die CSF-proteoom en individuele breinmodules beoordeel. Die analise het aan die lig gebring dat 'n totaal van 14 breinmodules in die CSF-datastel statisties beduidende oorvleuelings het (FDR aangepas P <0.05), en 'n bykomende module (M18) waarvan die oorvleueling naby aan betekenisvol is (FDR aangepas P = 0.06) (Figuur 4C) , boonste ry). Ons stel ook belang in modules wat sterk oorvleuel met differensieel uitgedrukte CSF-proteïene. Daarom het ons twee bykomende VOO-ontledings toegepas om te bepaal watter van (i) CSF-proteïen aansienlik verhoog is in AD en (ii) CSF-proteïen aansienlik verminder is in AD (P <0.05, gepaarde t-toets AD/kontrole) Breinmodules met betekenisvolle oorvleueling tussen hulle. Soos getoon in die middelste en onderste rye van Figuur 4C, toon hierdie bykomende ontledings dat 8 van die 44 breinmodules aansienlik oorvleuel met die proteïen wat in AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 en M38) bygevoeg word. . ), terwyl slegs twee modules (M6 en M15) 'n betekenisvolle oorvleueling met die verminderde proteïen in AD CSF getoon het. Soos verwag, is al 10 modules in die 15 modules met die hoogste oorvleueling met die CSF-proteoom. Daarom aanvaar ons dat hierdie 15 modules hoë-opbrengs bronne van AD brein-afgeleide CSF biomerkers is.
Ons het hierdie 15 oorvleuelende modules in vyf groot proteïenpanele gevou op grond van hul nabyheid in die WGCNA-boomdiagram en hul assosiasie met seltipes en geenontologie (Figuur 4D). Die eerste paneel bevat modules wat ryk is aan neuronmerkers en sinapsverwante proteïene (M1 en M12). Die sinaptiese paneel bevat 'n totaal van 94 proteïene, en die vlakke in die CSF-proteoom het aansienlik verander, wat dit die grootste bron van breinverwante CSF-merkers onder die vyf panele maak. Die tweede groep (M6 en M15) het die noue verband met endoteelselmerkers en vaskulêre liggaam gedemonstreer, soos "wondgenesing" (M6) en "regulering van humorale immuunrespons" (M15). M15 is ook hoogs verwant aan lipoproteïenmetabolisme, wat nou verwant is aan endoteel (36). Die vaskulêre paneel bevat 34 CSF-merkers wat met die brein verband hou. Die derde groep sluit modules (M2 en M4) in wat beduidend verband hou met oligodendrosietmerkers en selproliferasie. Byvoorbeeld, die topvlak ontologie terme van M2 sluit in "positiewe regulering van DNA replikasie" en "purien biosintese proses". Intussen sluit dié van M4 "gliale seldifferensiasie" en "chromosoomsegregasie" in. Die miëlineringspaneel bevat 49 CSF-merkers wat met die brein verband hou.
Die vierde groep bevat die meeste modules (M30, M29, M18, M24 en M5), en byna alle modules is aansienlik ryk aan mikroglia- en astrosietmerkers. Soortgelyk aan die miëlineringspaneel, bevat die vierde paneel ook modules (M30, M29 en M18) wat nou verwant is aan selproliferasie. Die ander modules in hierdie groep is hoogs verwant aan immunologiese terme, soos "immuuneffekproses" (M5) en "immuunresponsregulering" (M24). Die gliale immuungroep bevat 42 CSF-merkers wat met die brein verband hou. Laastens bevat die laaste paneel 52 breinverwante merkers op die vier modules (M44, M3, M33 en M38), wat almal op die liggaam is wat verband hou met energieberging en metabolisme. Die grootste van hierdie modules (M3) is nou verwant aan mitochondria en is ryk aan neuronspesifieke merkers. M38 is een van die kleiner modulelede in hierdie metaboloom en vertoon ook matige neuronspesifisiteit.
In die algemeen weerspieël hierdie vyf panele 'n wye reeks seltipes en -funksies in die AD-korteks, en bevat gesamentlik 271 breinverwante CSF-merkers (Tabel S2G). Om die geldigheid van hierdie MS-resultate te evalueer, het ons die proximity extension assay (PEA), 'n ortogonale teenliggaam-gebaseerde tegnologie met multiplekseringsvermoëns, hoë sensitiwiteit en spesifisiteit, gebruik en die serebrospinale vloeistofmonsters wat ons gevind het, herontleed. 'n Subset van hierdie 271 biomerkers (n = 36). Hierdie 36 teikens demonstreer die verandering in die AD-veelvoud van PEA, wat nou verwant is aan ons MS-gebaseerde bevindinge (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), wat die resultate van ons omvattende MS-analise sterk geverifieer het (Figuur S4) ).
Die biologiese temas wat deur ons vyf groepe beklemtoon word, van sinaptiese sein tot energiemetabolisme, hou almal verband met die patogenese van AD (1-3). Daarom is al 15 modules wat hierdie panele bevat verwant aan die AD-patologie in die breinproteoom wat ons ontdek het (Figuur 2B). Die mees noemenswaardige is die hoë positiewe patologiese korrelasie tussen ons gliale modules en die sterk negatiewe patologiese korrelasie tussen ons grootste neuronale modules (M1 en M3). Die differensiële uitdrukkingsanalise van ons gerepliseerde breinproteoom (Figuur S3D) beklemtoon ook M5- en M18-afgeleide gliale proteïene. In AsymAD en simptomatiese AD, die meeste verhoogde gliale proteïene en M1-verwante sinapse. Die proteïen word die meeste verminder. Hierdie waarnemings dui aan dat die 271 serebrospinale vloeistofmerkers wat ons in die vyf groepe geïdentifiseer het, verband hou met siekteprosesse in die AD-korteks, insluitend dié wat in die vroeë asimptomatiese stadiums voorkom.
Ten einde die veranderingsrigting van die paneelproteïene in die brein en spinale vloeistof beter te ontleed, het ons die volgende vir elk van die 15 oorvleuelende modules geteken: (i) het die module-oorvloedvlak in die breindatastel gevind en (ii) die module proteïen Die verskil word uitgedruk in die serebrospinale vloeistof (Figuur S5). Soos vroeër genoem, word WGCNA gebruik om die module-oorvloed of kenmerkende proteïenwaarde in die brein te bepaal (13). Die vulkaankaart word gebruik om die differensiële uitdrukking van modulêre proteïene in die serebrospinale vloeistof (AD/kontrole) te beskryf. Hierdie syfers toon dat drie van die vyf panele verskillende uitdrukkingstendense in die brein en spinale vloeistof toon. Die twee modules van die sinapspaneel (M1 en M12) toon 'n afname in die oorvloedvlak in die AD-brein, maar oorvleuel aansienlik met die verhoogde proteïen in die AD CSF (Figuur S5A). Die neuronverwante modules wat die metaboloom (M3 en M38) bevat, het soortgelyke brein- en serebrospinale vloeistof uitdrukkingspatrone inkonsekwent getoon (Figuur S5E). Die vaskulêre paneel het ook verskillende uitdrukkingstendense getoon, alhoewel sy modules (M6 en M15) matig verhoog is in die AD-brein en afgeneem in die siek CSF (Figuur S5B). Die oorblywende twee panele bevat groot gliale netwerke waarvan die proteïene konsekwent opgereguleer word in beide kompartemente (Figuur S5, C en D).
Neem asseblief kennis dat hierdie neigings nie algemeen is vir alle merkers in hierdie panele nie. Byvoorbeeld, die sinaptiese paneel sluit verskeie proteïene in wat aansienlik verminder word in die AD-brein en CSF (Figuur S5A). Onder hierdie af-gereguleerde serebrospinale vloeistof merkers is NPTX2 en VGF van M1, en chromogranien B van M12. Ten spyte van hierdie uitsonderings is die meeste van ons sinaptiese merkers egter verhoog in AD-ruggraatvloeistof. Oor die algemeen was hierdie ontledings in staat om statisties beduidende neigings in brein- en serebrospinale vloeistofvlakke in elk van ons vyf panele te onderskei. Hierdie neigings beklemtoon die komplekse en dikwels verskillende verhouding tussen brein- en CSF-proteïenuitdrukking in AD.
Toe het ons hoë-deurset MS-replikasie-analise (CSF-replikasie 1) gebruik om ons 271 stel biomerkers te vernou tot die mees belowende en reproduceerbare teikens (Figuur 5A). CSF-kopie 1 bevat 'n totaal van 96 monsters van Emory Goizueta ADRC, insluitend kontrole-, AsymAD- en AD-kohort (Tabel S1A). Hierdie AD gevalle word gekenmerk deur ligte kognitiewe afname (gemiddelde MoCA, 20.0 ± 3.8), en veranderinge in AD biomerkers bevestig in serebrospinale vloeistof (Tabel S1A). In teenstelling met die CSF-analise wat ons gevind het, word hierdie replikasie uitgevoer met behulp van 'n meer doeltreffende en hoë-deurset "enkelskoot" MS metode (sonder aflyn fraksionering), insluitend 'n vereenvoudigde monster voorbereiding protokol wat die behoefte aan immunodepletie van individuele monsters uitskakel . In plaas daarvan word 'n enkele immuun-uitgeputte "verbeteringskanaal" gebruik om die sein van minder volop proteïene te versterk (37). Alhoewel dit die totale proteoomdekking verminder, verminder hierdie enkelskootmetode masjientyd aansienlik en verhoog die aantal TMT-gemerkte monsters wat lewensvatbaar ontleed kan word (17, 38). In totaal het die ontleding 6 487 peptiede geïdentifiseer, wat in 96 gevalle na 1 183 proteome gekarteer is. Soos met die CSF-analise wat ons gevind het, is slegs daardie proteïene wat in ten minste 50% van die monsters gekwantifiseer is by die daaropvolgende berekeninge ingesluit, en die data is teruggetrek vir die effekte van ouderdom en geslag. Dit het gelei tot die finale kwantifisering van 792 proteome, waarvan 95% ook geïdentifiseer is in die CSF-datastel wat gevind is.
(A) Breinverwante CSF-proteïen-teikens geverifieer in die eerste gerepliseerde CSF-kohort en ingesluit in die finale paneel (n = 60). (B tot E) Paneelbiomerkervlakke (saamgestelde z-tellings) gemeet in die vier CSF-replikasiekohorte. Gepaarde t-toetse of ANOVA met Tukey se na-korreksie is gebruik om die statistiese betekenisvolheid van die veranderinge in oorvloed in elke herhaalde analise te evalueer. CT, beheer.
Aangesien ons veral daarin belangstel om ons 271 breinverwante CSF-teikens deur omvattende analise te verifieer, sal ons verdere ondersoek van hierdie gerepliseerde proteoom tot hierdie merkers beperk. Onder hierdie 271 proteïene is 100 opgespoor in CSF replikasie 1. Figuur S6A toon die differensiële uitdrukking van hierdie 100 oorvleuelende merkers tussen die kontrole en AD replikasie monsters. Sinaptiese en metaboliethistone neem die meeste toe in AD, terwyl vaskulêre proteïene die meeste afneem in siekte. Die meeste van die 100 oorvleuelende merkers (n = 70) het dieselfde rigting van verandering in die twee datastelle gehandhaaf (Figuur S6B). Hierdie 70 bekragtigde breinverwante CSF-merkers (Tabel S2H) weerspieël grootliks die voorheen waargenome paneeluitdrukkingstendense, dit wil sê die afregulering van vaskulêre proteïene en die opregulering van alle ander panele. Slegs 10 van hierdie 70 bekragtigde proteïene het veranderinge in AD oorvloed getoon wat hierdie paneelneigings weerspreek het. Om 'n paneel te genereer wat die algehele neiging van die brein en serebrospinale vloeistof die beste weerspieël, het ons hierdie 10 proteïene uitgesluit van die paneel van belang wat ons uiteindelik geverifieer het (Figuur 5A). Daarom bevat ons paneel uiteindelik 'n totaal van 60 proteïene wat in twee onafhanklike CSF AD-kohorte geverifieer is deur verskillende monstervoorbereiding en MS-platformanalise te gebruik. Die z-telling uitdrukking plotte van hierdie finale panele in die CSF kopie 1 kontrole en AD gevalle bevestig die paneel tendens waargeneem in die CSF kohort wat ons gevind het (Figuur 5B).
Onder hierdie 60 proteïene is daar molekules wat bekend is dat hulle met AD geassosieer word, soos osteopontien (SPP1), wat 'n pro-inflammatoriese sitokien is wat in baie studies met AD geassosieer is (39-41), en GAP43, 'n sinaptiese proteïen wat duidelik gekoppel is aan neurodegenerasie (42). Die mees volledig geverifieerde proteïene is merkers wat verband hou met ander neurodegeneratiewe siektes, soos amiotrofiese laterale sklerose (ALS) verwante superoksied dismutase 1 (SOD1) en Parkinson se siekte verwante desakkarase (PARK7). Ons het ook geverifieer dat baie ander merkers, soos SMOC1 en breinryke membraanaanhegtingsseinproteïen 1 (BASP1), vorige skakels na neurodegenerasie beperk het. Dit is opmerklik dat as gevolg van hul lae algehele oorvloed in die CSF-proteoom, dit vir ons moeilik is om hierdie hoë-deurset enkelskoot-opsporingsmetode te gebruik om MAPT en sekere ander AD-verwante proteïene (byvoorbeeld NEFL en NRGN) betroubaar op te spoor. ) ( 43, 44).
Ons het toe hierdie 60 prioriteitspaneelmerkers nagegaan in drie bykomende herhalingsontledings. In CSF Copy 2 het ons 'n enkele TMT-MS gebruik om 'n onafhanklike kohort van 297 kontrole- en AD-monsters van Emory Goizueta ADRC (17) te ontleed. CSF-replikasie 3 het 'n heranalise van beskikbare TMT-MS-data van 120 kontrole- en AD-pasiënte van Lausanne, Switserland (45) ingesluit. Ons het meer as twee derdes van die 60 prioriteitsmerkers in elke datastel opgespoor. Alhoewel die Switserse studie verskillende MS-platforms en TMT-kwantifiseringsmetodes (45, 46) gebruik het, het ons ons paneeltendense sterk weergegee in twee herhaalde ontledings (Figuur 5, C en D, en Tabelle S2, I en J). Om die siektespesifisiteit van ons groep te evalueer, het ons TMT-MS gebruik om die vierde replikasiedatastel (CSF-replikasie 4) te ontleed, wat nie net kontrole (n = 18) en AD (n = 17) gevalle ingesluit het nie, maar ook PD ( n = 14)), ALS (n = 18) en frontotemporale demensie (FTD) monsters (n = 11) (Tabel S1A). Ons het byna twee derdes van die paneelproteïene in hierdie kohort suksesvol gekwantifiseer (38 uit 60). Hierdie resultate beklemtoon die AD-spesifieke veranderinge in al vyf biomerkerpanele (Figuur 5E en Tabel S2K). Die toename in die metabolietgroep het die sterkste AD-spesifisiteit getoon, gevolg deur die miëlinasie- en gliale groep. In 'n mindere mate toon FTD ook 'n toename tussen hierdie panele, wat soortgelyke potensiële netwerkveranderinge kan weerspieël (17). Daarteenoor het ALS en PD byna dieselfde miëlinasie-, gliale- en metaboloomprofiele as die kontrolegroep getoon. Algehele, ten spyte van verskille in monstervoorbereiding, MS-platform en TMT-kwantifiseringsmetodes, toon hierdie herhaalde ontledings dat ons prioriteitspaneelmerkers hoogs konsekwente AD-spesifieke veranderinge in meer as 500 unieke CSF-monsters het.
AD neurodegenerasie is wyd erken etlike jare voor die aanvang van kognitiewe simptome, so daar is 'n dringende behoefte aan biomerkers van AsymAD (5, 31). Meer en meer bewyse toon egter dat die biologie van AsymAD ver van homogeen is, en die komplekse interaksie van risiko en veerkragtigheid lei tot groot individuele verskille in die daaropvolgende siekteprogressie (47). Alhoewel dit gebruik word om AsymAD-gevalle te identifiseer, het die vlakke van kern CSF-biomerkers (Aβ1-42, totaal tau en p-tau) nie bewys dat dit betroubaar kan voorspel wie tot demensie sal vorder nie (4, 7), wat meer aandui. nodig om holistiese biomerker-instrumente gebaseer op verskeie aspekte van breinfisiologie in te sluit om die risiko van hierdie bevolking akkuraat te stratifiseer. Daarom het ons ons AD-gevalideerde biomerkerpaneel in die AsymAD-populasie van CSF-kopie 1 ontleed. Hierdie 31 AsymAD-gevalle het abnormale kernbiomerkervlakke (Aβ1–42/totale tau ELISA-verhouding, <5.5) en volledige kognisie (gemiddelde MoCA, 27.1) getoon ± 2.2) (Tabel S1A). Daarbenewens het alle individue met AsymAD 'n kliniese demensie-telling van 0, wat aandui dat daar geen bewyse is van 'n afname in daaglikse kognitiewe of funksionele prestasie nie.
Ons het eers die vlakke van die gevalideerde panele in al 96 CSF-herhalings 1 ontleed, insluitend die AsymAD-kohort. Ons het gevind dat verskeie panele in die AsymAD-groep beduidende AD-agtige oorvloed veranderinge gehad het, die vaskulêre paneel het 'n afwaartse neiging in AsymAD getoon, terwyl alle ander panele 'n opwaartse neiging getoon het (Figuur 6A). Daarom het alle panele 'n hoogs beduidende korrelasie met ELISA Aβ1-42 en totale tau-vlakke getoon (Figuur 6B). Daarteenoor is die korrelasie tussen die groep en die MoCA-telling relatief swak. Een van die meer treffende bevindinge van hierdie ontledings is die groot verskeidenheid paneeloorvloede in die AsymAD-kohort. Soos getoon in Figuur 6A, kruis die paneelvlak van die AsymAD-groep gewoonlik die paneelvlak van die kontrolegroep en die AD-groep, wat relatief hoë variasie toon. Om hierdie heterogeniteit van AsymAD verder te verken, het ons Multidimensionele Skaal (MDS) analise toegepas op 96 CSF replikasie 1 gevalle. MDS-analise laat toe om die ooreenkoms tussen gevalle te visualiseer op grond van sekere veranderlikes in die datastel. Vir hierdie trosanalise gebruik ons slegs daardie gevalideerde paneelmerkers wat 'n statisties beduidende verandering (P <0.05, AD/kontrole) in die CSF-ontdekking en replikasie 1 proteoom (n = 29) (Tabel S2L) vlak het. Hierdie analise het duidelike ruimtelike groepering tussen ons beheer- en AD-gevalle opgelewer (Figuur 6C). In teenstelling hiermee is sommige AsymAD-gevalle duidelik in die kontrolegroep gegroepeer, terwyl ander in AD-gevalle geleë is. Om hierdie AsymAD-heterogeniteit verder te verken, het ons ons MDS-kaart gebruik om twee groepe van hierdie AsymAD-gevalle te definieer. Die eerste groep het AsymAD-gevalle ingesluit wat nader aan die kontrole gegroepeer is (n = 19), terwyl die tweede groep gekenmerk is deur AsymAD-gevalle met 'n merkerprofiel nader aan AD (n = 12).
(A) Die uitdrukkingsvlak (z-telling) van die CSF-biomerkergroep in al 96 monsters in die CSF-replikasie 1-kohort, insluitend AsymAD. Variansie-analise met Tukey se na-korreksie is gebruik om die statistiese betekenisvolheid van paneel oorvloed veranderinge te evalueer. (B) Korrelasie analise van paneel proteïen oorvloed vlak (z-telling) met MoCA telling en totale tau vlak in ELISA Aβ1-42 en CSF kopie 1 monsters. Die Pearson-korrelasiekoëffisiënt met die relevante P-waarde word vertoon. (C) Die MDS van 96 CSF kopie 1 gevalle was gebaseer op die oorvloed vlakke van 29 gevalideerde paneel merkers, wat aansienlik verander is in beide die ontdekking en CSF kopie 1 datastelle [P <0.05 AD/kontrole (CT)]. Hierdie analise is gebruik om die AsymAD-groep in kontrole (n = 19) en AD (n = 12) subgroepe te verdeel. (D) Die vulkaan plot toon die differensiële uitdrukking van alle CSF replikasie 1 proteïene met log2 vou verandering (x-as) relatief tot die -log10 statistiese P waarde tussen die twee AsymAD subgroepe. Die paneel biomerkers is gekleur. (E) CSF replikasie 1 oorvloed vlak van die seleksie groep biomerkers word differensieel uitgedruk tussen AsymAD subgroepe. Tukey se na-aangepaste variansieanalise is gebruik om statistiese betekenisvolheid te bepaal.
Ons het die differensiële proteïenuitdrukking tussen hierdie kontrole en AD-agtige AsymAD-gevalle ondersoek (Figuur 6D en Tabel S2L). Die gevolglike vulkaankaart toon dat 14 paneelmerkers aansienlik verander het tussen die twee groepe. Die meeste van hierdie merkers is lede van die sinaps en metaboloom. SOD1 en myristoïleerde alanienryke proteïenkinase C-substraat (MARCKS), wat onderskeidelik lede van die miëlien- en gliale immuungroepe is, behoort egter ook aan hierdie groep (Figuur 6, D en E). Die vaskulêre paneel het ook twee merkers bygedra wat aansienlik verminder is in die AD-agtige AsymAD groep, insluitend AE bindende proteïen 1 (AEBP1) en komplement familielid C9. Daar was geen beduidende verskil tussen die kontrole en AD-agtige AsymAD subgroepe in ELISA AB1-42 (P = 0.38) en p-tau (P = 0.28), maar daar was inderdaad 'n beduidende verskil in die totale tau vlak (P = 0.0031) ) (Fig. S7). Daar is verskeie paneelmerkers wat aandui dat die veranderinge tussen die twee AsymAD-subgroepe meer betekenisvol is as die totale tau-vlakke (byvoorbeeld YWHAZ, SOD1 en MDH1) (Figuur 6E). In die algemeen dui hierdie resultate aan dat ons gevalideerde paneel biomerkers kan bevat wat kan subtipeer en potensiële risiko-stratifikasie van pasiënte met asimptomatiese siekte.
Daar is 'n dringende behoefte aan stelselgebaseerde biomerker-instrumente om die verskillende patofisiologie agter AD beter te meet en te teiken. Daar word verwag dat hierdie instrumente nie net ons AD-diagnostiese raamwerk sal verander nie, maar ook die aanvaarding van effektiewe, pasiëntspesifieke behandelingstrategieë sal bevorder (1, 2). Vir hierdie doel het ons 'n onbevooroordeelde omvattende proteomika-benadering tot AD-brein en CSF toegepas om webgebaseerde CSF-biomerkers te identifiseer wat 'n wye reeks breingebaseerde patofisiologie weerspieël. Ons ontleding het vyf CSF-biomerkerpanele opgelewer, wat (i) sinapse, bloedvate, miëlien, immuun- en metaboliese disfunksie weerspieël; (ii) sterk reproduceerbaarheid op verskillende MS-platforms te demonstreer; (iii) Toon progressiewe siekte-spesifieke veranderinge regdeur die vroeë en laat stadiums van AD. In die algemeen verteenwoordig hierdie bevindinge 'n belowende stap in die rigting van die ontwikkeling van diverse, betroubare, web-georiënteerde biomerker-instrumente vir AD-navorsing en kliniese toepassings.
Ons resultate demonstreer die hoogs bewaarde organisasie van die AD-breinnetwerkproteoom en ondersteun die gebruik daarvan as 'n anker vir sisteemgebaseerde biomerkerontwikkeling. Ons ontleding toon dat twee onafhanklike TMT-MS-datastelle wat AD- en AsymAD-breine bevat sterk modulariteit het. Hierdie bevindinge brei ons vorige werk uit en demonstreer die behoud van die kragtige modules van meer as 2 000 breinweefsels van verskeie onafhanklike kohorte in die frontale, pariëtale en temporale korteks (17). Hierdie konsensusnetwerk weerspieël verskeie siekteverwante veranderinge wat in huidige navorsing waargeneem is, insluitend die toename van gliale-ryke inflammatoriese modules en die afname van neuronryke modules. Soos huidige navorsing, bevat hierdie grootskaalse netwerk ook beduidende modulêre veranderinge in AsymAD, wat 'n verskeidenheid verskillende prekliniese patofisiologie toon (17).
Binne hierdie hoogs konserwatiewe sisteemgebaseerde raamwerk is daar egter meer fynkorrelige biologiese heterogeniteit, veral onder individue in die vroeë stadiums van AD. Ons biomerkerpaneel is in staat om twee subgroepe in AsymAD uit te beeld, wat die beduidende differensiële uitdrukking van veelvuldige CSF-merkers demonstreer. Ons groep kon die biologiese verskille tussen hierdie twee subgroepe uitlig, wat nie duidelik was op die vlak van kern AD-biomerkers nie. In vergelyking met die kontrolegroep was die Aβ1-42/totale tau verhoudings van hierdie AsymAD individue abnormaal laag. Slegs die totale tau vlakke was egter betekenisvol verskillend tussen die twee AsymAD subgroepe, terwyl die Aβ1-42 en p-tau vlakke relatief vergelykbaar gebly het. Aangesien hoë CSF-tau 'n beter voorspeller van kognitiewe simptome is as Aβ1-42-vlakke (7), vermoed ons dat die twee AsymAD-kohorte verskillende risiko's van siektevordering kan hê. Gegewe die beperkte steekproefgrootte van ons AsymAD en die gebrek aan longitudinale data, is verdere navorsing nodig om hierdie gevolgtrekkings met selfvertroue te maak. Hierdie resultate dui egter daarop dat 'n sisteem-gebaseerde CSF-paneel ons vermoë kan verbeter om individue effektief te stratifiseer tydens die asimptomatiese stadium van die siekte.
Oor die algemeen ondersteun ons bevindinge die rol van veelvuldige biologiese funksies in die patogenese van AD. Gedisreguleerde energiemetabolisme het egter die prominente tema van al ons vyf bekragtigde etiketteringpanele geword. Metaboliese proteïene, soos hipoksantien-guanien-fosforibosieltransferase 1 (HPRT1) en laktaatdehidrogenase A (LDHA), is die mees sterk bekragtigde sinaptiese biomerkers, wat aandui dat die toename in AD CSF hoogs reproduseerbare seks is. Ons bloedvate en gliale panele bevat ook verskeie merkers wat betrokke is by die metabolisme van oksidatiewe stowwe. Hierdie bevindinge stem ooreen met die sleutelrol wat metaboliese prosesse in die hele brein speel, nie net om aan die hoë energievraag van neurone te voldoen nie, maar ook om aan die hoë energievraag van astrocyte en ander gliale selle te voldoen (17, 48). Ons resultate ondersteun groeiende bewyse dat veranderinge in redokspotensiaal en onderbreking van energiebane die kernskakel kan wees tussen verskeie sleutelprosesse betrokke by die patogenese van AD, insluitend mitochondriale versteurings, gliale-gemedieerde inflammasie en vaskulêre skade (49). Daarbenewens bevat die metaboliese serebrospinale vloeistof biomerkers 'n groot aantal differensieel ryk proteïene tussen ons beheer en AD-agtige AsymAD subgroepe, wat daarop dui dat die ontwrigting van hierdie energie en redoks weë krities kan wees in die prekliniese stadium van die siekte.
Die verskillende brein- en serebrospinale vloeistofpaneelneigings wat ons waargeneem het, het ook interessante biologiese implikasies. Sinapse en metabolome ryk aan neurone toon verlaagde vlakke in die AD-brein en verhoogde oorvloed in serebrospinale vloeistof. Aangesien neurone ryk is aan energie-produserende mitochondria by sinapse om energie te verskaf vir hul talle gespesialiseerde seine (50), word die ooreenkoms van die uitdrukkingsprofiele van hierdie twee neurongroepe verwag. Die verlies van neurone en die ekstrusie van beskadigde selle kan hierdie brein- en CSF-paneelneigings in latere siektes verklaar, maar hulle kan nie die vroeë paneelveranderinge wat ons waarneem, verduidelik nie (13). Een moontlike verklaring vir hierdie bevindings in vroeë asimptomatiese siekte is abnormale sinaptiese snoei. Nuwe bewyse in muismodelle dui daarop dat mikroglia-gemedieerde sinaptiese fagositose abnormaal in AD geaktiveer kan word en kan lei tot vroeë sinapsverlies in die brein (51). Hierdie weggooide sinaptiese materiaal kan in CSF ophoop, en daarom sien ons die toename in CSF in die neuronpaneel. Immuun-gemedieerde sinaptiese snoei kan ook die toename in gliale proteïene wat ons in die brein en serebrospinale vloeistof deur die hele siekteproses waarneem, gedeeltelik verklaar. Benewens sinaptiese snoei, kan algehele abnormaliteite in die eksositiese pad ook lei tot verskillende brein- en CSF-uitdrukkings van neuronale merkers. 'n Aantal studies het getoon dat die inhoud van eksosome in die patogenese van AD-brein verander het (52). Die ekstrasellulêre pad is ook betrokke by die proliferasie van Aβ (53, 54). Dit is opmerklik dat onderdrukking van eksosomale afskeiding AD-agtige patologie in AD transgeniese muismodelle kan verminder (55).
Terselfdertyd het die proteïen in die vaskulêre paneel 'n matige toename in die AD-brein getoon, maar aansienlik afgeneem in die CSF. Die bloed-breinversperring (BBB) disfunksie kan hierdie bevindings gedeeltelik verklaar. Baie onafhanklike nadoodse menslike studies het BBB-afbreking in AD getoon (56, 57). Hierdie studies het verskeie abnormale aktiwiteite rondom hierdie dig verseëlde laag endoteelselle bevestig, insluitend breinkapillêre lekkasie en perivaskulêre ophoping van bloedgedraagde proteïene (57). Dit kan 'n eenvoudige verduideliking vir die verhoogde vaskulêre proteïene in die brein verskaf, maar dit kan nie die uitputting van dieselfde proteïene in die serebrospinale vloeistof volledig verklaar nie. Een moontlikheid is dat die sentrale senuweestelsel hierdie molekules aktief isoleer om die probleem van verhoogde inflammasie en oksidatiewe stres op te los. Die vermindering in sommige van die ernstigste CSF-proteïene in hierdie paneel, veral dié wat betrokke is by lipoproteïenregulering, hou verband met die inhibisie van skadelike vlakke van inflammasie en die neurobeskermende proses van reaktiewe suurstofspesies. Dit is waar vir Paroxonase 1 (PON1), 'n lipoproteïenbindende ensiem wat verantwoordelik is vir die vermindering van oksidatiewe stresvlakke in die sirkulasie (58, 59). Alfa-1-mikroglobulien/bikunien-voorloper (AMBP) is nog 'n aansienlik af-gereguleerde merker van die vaskulêre groep. Dit is die voorloper van die lipiedvervoerder bikunien, wat ook betrokke is by inflammasieonderdrukking en neurologiese beskerming (60, 61).
Ten spyte van verskeie interessante hipoteses, is die onvermoë om biochemiese siektemeganismes direk op te spoor 'n bekende beperking van ontdekkingsgedrewe proteomika-analise. Daarom is verdere navorsing nodig om die meganismes agter hierdie biomerkerpanele met selfvertroue te definieer. Ten einde te beweeg na die ontwikkeling van MS-gebaseerde kliniese analise, die toekomstige rigting vereis ook die gebruik van geteikende kwantitatiewe metodes vir grootskaalse biomerker verifikasie, soos selektiewe of parallelle reaksie monitering (62). Ons het onlangs parallelle reaksiemonitering (63) gebruik om baie van die CSF-proteïenveranderinge wat hier beskryf word, te bekragtig. Verskeie prioriteitspaneelteikens word met beduidende akkuraatheid gekwantifiseer, insluitend YWHAZ, ALDOA en SMOC1, wat onderskeidelik na ons sinaps-, metabolisme- en inflammasiepanele karteer (63). Onafhanklike dataverkryging (DIA) en ander MS-gebaseerde strategieë kan ook nuttig wees vir teikenverifikasie. Bud et al. (64) Dit is onlangs gedemonstreer dat daar 'n beduidende oorvleueling is tussen die AD-biomerkers wat in ons CSF-ontdekkingsdatastel geïdentifiseer is en die onafhanklike DIA-MS-datastel, wat bestaan uit byna 200 CSF-monsters van drie verskillende Europese kohorte. Hierdie onlangse studies ondersteun die potensiaal van ons panele om te transformeer in betroubare MS-gebaseerde opsporing. Tradisionele teenliggaampies en aptamer-gebaseerde opsporing is ook belangrik vir die verdere ontwikkeling van sleutel AD biomerkers. As gevolg van die lae oorvloed van CSF, is dit moeiliker om hierdie biomerkers op te spoor met behulp van hoë-deurset MS metodes. NEFL en NRGN is twee sulke voorbeelde van CSF-biomerkers met 'n lae oorvloed, wat in ons omvattende ontleding na die paneel gekarteer word, maar nie betroubaar opgespoor kan word met ons enkele MS-strategie nie. Teikenstrategieë gebaseer op veelvuldige teenliggaampies, soos PEA, kan die kliniese transformasie van hierdie merkers bevorder.
Oor die algemeen bied hierdie studie 'n unieke proteomika-benadering vir die identifikasie en verifikasie van CSF AD-biomerkers gebaseer op verskillende stelsels. Die optimalisering van hierdie merkerpanele oor bykomende AD-kohorte en MS-platforms kan belowend wees om AD-risiko-stratifikasie en behandeling te bevorder. Studies wat die longitudinale vlak van hierdie panele oor tyd evalueer, is ook van kritieke belang om te bepaal watter kombinasie van merkers die risiko van vroeë siekte en veranderinge in siekte-erns die beste stratifiseer.
Behalwe vir die 3 monsters wat deur CSF gekopieer is, is alle CSF-monsters wat in hierdie studie gebruik is, ingesamel onder die beskerming van Emory ADRC of naverwante navorsingsinstellings. 'n Totaal van vier stelle Emory CSF-monsters is in hierdie proteomika-studies gebruik. Daar is gevind dat die CSF-kohort monsters van 20 gesonde kontroles en 20 AD-pasiënte bevat. CSF-kopie 1 sluit monsters van 32 gesonde kontroles, 31 AsymAD-individue en 33 AD-individue in. CSF-kopie 2 bevat 147 kontroles en 150 AD-monsters. Die multi-siekte CSF replikasie 4 kohort het 18 kontroles, 17 AD, 19 ALS, 13 PD en 11 FTD monsters ingesluit. Volgens die ooreenkoms wat deur die Emory Universiteit Institusionele Hersieningsraad goedgekeur is, het alle Emory-studiedeelnemers ingeligte toestemming verkry. Volgens die 2014 National Institute of Aging Best Practice-riglyne vir Alzheimer-sentrums (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), is serebrospinale vloeistof deur lumbale punksie versamel en gestoor. Beheer- en AsymAD- en AD-pasiënte het gestandaardiseerde kognitiewe assessering by Emory Cognitive Neurology Clinic of Goizueta ADRC ontvang. Hul serebrospinale vloeistofmonsters is getoets deur INNO-BIA AlzBio3 Luminex vir ELISA Aβ1-42, totale tau en p-tau analise (65). ELISA-waardes word gebruik om die diagnostiese klassifikasie van proefpersone te ondersteun gebaseer op gevestigde AD-biomerker-afsnykriteria (66, 67). Basiese demografiese en diagnostiese data vir ander CSF-diagnoses (FTD, ALS en PD) word ook van Emory ADRC of geaffilieerde navorsingsinstellings verkry. Die opsomming van gevalle metadata vir hierdie Emory CSF gevalle kan gevind word in Tabel S1A. Die kenmerke van die Switserse CSF-replikasie 3-kohort is voorheen gepubliseer (45).
CSF het die monster gevind. Ten einde die diepte van ons ontdekking van die CSF-datastel te verhoog, is immuunverbruik van hoë-oorvloed proteïene uitgevoer voor tripsinisering. Kortliks, 130 μl CSF van 40 individuele CSF-monsters en 'n gelyke volume (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) is in 'n spinkolom (Thermo Fisher Scientific, A89868) by kamer geplaas temperatuur Inkubeer). Nadat jy vir 15 minute gedraai het, sentrifugeer die monster vir 2 minute by 1000g. 'n 3K ultrasentrifugale filtertoestel (Millipore, UFC500396) is gebruik om die uitvloeiselmonster te konsentreer deur te sentrifugering by 14 000 g vir 30 minute. Verdun alle monstervolumes tot 75 μl met fosfaatgebufferde soutoplossing. Die proteïenkonsentrasie is geëvalueer deur die bisinchoniensuur (BCA) metode volgens die vervaardiger se protokol (Thermo Fisher Scientific). Die immuun-uitgeputte CSF (60 μl) van al 40 monsters is verteer met lisiel endopeptidase (LysC) en tripsien. Kortliks, die monster is gereduseer en gealkieleer met 1.2 μl 0.5 M tris-2(-karboksietiel)-fosfien en 3 μl 0.8 M chloorasetamied by 90°C vir 10 minute, en dan vir 15 minute in 'n waterbad gesoniceer. Die monster is verdun met 193 μl 8 M ureumbuffer [8 M ureum en 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] tot 'n finale konsentrasie van 6 M ureum. LysC (4,5 μg; Wako) word gebruik vir oornag vertering by kamertemperatuur. Die monster is dan verdun tot 1 M ureum met 50 mM ammoniumbikarbonaat (ABC) (68). Voeg 'n gelyke hoeveelheid (4,5 μg) tripsien (Promega) by en inkubeer dan die monster vir 12 uur. Versuur die verteerde peptiedoplossing tot 'n finale konsentrasie van 1% mieresuur (FA) en 0.1% trifluoroasynsuur (TFA) (66), en ontsout dan met 'n 50 mg Sep-Pak C18 kolom (Waters) soos hierbo beskryf (25) . Die peptied is dan in 1 ml 50% asetonitriel (ACN) geëlueer. Om proteïen-kwantifisering oor groepe (25) te standaardiseer, is 100 μl hoeveelhede van al 40 CSF-monsters gekombineer om 'n gemengde monster te genereer, wat dan in vyf globale interne standaard (GIS) (48) monsters verdeel is. Alle individuele monsters en gekombineerde standaarde word gedroog deur hoëspoedvakuum (Labconco).
CSF kopieer die monster. Dayon en kollegas het voorheen immuunuitputting en vertering van CSF-kopie 3-monsters beskryf (45, 46). Die oorblywende replikaatmonsters was nie individueel immuunverarm nie. Verteer hierdie onverwyderde monsters in tripsien soos voorheen beskryf (17). Vir elke herhaalde analise is 120 μl hoeveelhede van die geëlueerde peptied van elke monster saamgevoeg en in gelyke volume hoeveelhede verdeel om as die TMT-gemerkte globale interne standaard gebruik te word (48). Alle individuele monsters en gekombineerde standaarde word gedroog deur hoëspoedvakuum (Labconco). Ten einde die sein van die lae-oorvloed CSF-proteïen te verbeter, deur 125 μl van elke monster te kombineer, is 'n "verbeterde" monster voorberei vir elke herhalingsanalise [dws 'n biologiese monster wat die navorsingmonster naboots, maar die beskikbare hoeveelheid is veel groter (37, 69)] saamgesmelt in 'n gemengde CSF monster (17). Die gemengde monster is dan immuunverwyder deur gebruik te maak van 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), verteer soos hierbo beskryf, en ingesluit in die daaropvolgende veelvuldige TMT-etikettering.
Postyd: 27 Aug. 2021